Мультиплексированный Флуорометрический Методология тестирования иммунологического анализа и устранение неисправностей

Общей целью данного эксперимента является обнаружение антител против случайных инфекционных агентов у лабораторных животных. Это достигается путем инкубации тестовой сыворотки с микросферами, покрытыми антигеном. Затем сыворотку инкубируют с биотинилированным меченым видоспецифичным антииммуноглобулином, который обнаруживает любые иммунные комплексы антигенных антител.

Затем добавляют меченный стрептавидином раствор FICO eryn Fluor force для обнаружения любых результатов биотинилированного иммуноглобулина, которые показывают положительный или отрицательный статус антител к распространенным агентам у лабораторных грызунов на основе мультиплексной флуоресценции, чистой оценки иммуноанализа, значений флуоресцентных образцов. Основное преимущество использования этой методики по сравнению с существующим методом, таким как метод Элизы, заключается в том, что MFIA является мультиплексным анализом. Это позволяет исследователю проверять до ста различных анализов в одном тесте.

Что ж, этот метод уменьшает количество областей сыворотки и одноразовых материалов, используемых в существующих методах, при этом увеличивая объем информации, получаемой из одного теста. Идея использования этого метода пришла нам в голову, когда мы тестировали большое количество образцов сывороток для нескольких агентов и хотели сократить трудозатраты, а также время тестирования. Демонстрировать процедуру будет Донна Коэн, старший технолог из нашей лаборатории. Для начала подготовьте два буфера, необходимые для мультиплексного, флуоресцентного, иммунологического анализа или процедуры MFIA.

Первый представляет собой первичный разбавитель, который доступен от Charles River и содержит запатентованные блокирующие агенты для уменьшения неспецифических взаимодействий для буфера для промывки. Приготовьте раствор PBS с 1% BSA pH 7,4 для удаления твердых частиц. Отфильтруйте буфер через блок с крышкой бутылки размером 0,2 микрона в стерильные контейнеры с маркировкой с помощью буфера для промывки.

Приготовьте две x концентрации биотинилированных антис-веществ, IGG или BAG и стрептококка AVID и FICO erything или SPE, которые будут использоваться для мечения комплексов антител к антигенам, образующихся на стадии инкубации тестовой сыворотки, для получения образцов из следующих материалов и одноразовых материалов, собранных многоканальных и одноканальных микропипеток и наконечников, а также 96 хорошо связывающих белок микротитровых планшетов для разведения белка. После сбора образцов крови и выделения сывороточного вихря сыворотку на короткое время перед разбавлением образцов в первичном разбавителе в 96-луночном микротитровом планшете для обеспечения надлежащей и равномерной эвакуации из скважины перед предварительным увлажнением. Каждая лунка из 96 лунок испытательной пластины с буфером для промывки медленно отсасывает раствор на протяжении всего анализа.

Аспирация должна занимать от 5 до 10 секунд, чтобы предотвратить агрегацию гранул и уплотнение гранул в фильтрующей мембране, что может замедлить время считывания в конце анализа. Убедитесь, что сток жидкости прекратился, промокнув нижнюю сторону тестовой пластины бумажными полотенцами. Важно промакивать тестовую пластину после каждого этапа промывки, чтобы предотвратить впитывание влаги из лунок во время инкубации.

Подготовка бусин начинается с вортексирования приклада на спаренном бусе подвеса. Затем кратко пропитайте их ультразвуком в ванночке. Очень важно правильно подвешивать валики, чтобы предотвратить скопление агрегированных бусин, которые могут привести к увеличению времени считывания.

Затем диспонируйте 20-кратную суспензию в растворе двух рабочих валиков в первичном разбавителе. Затем нанесите по 50 микролитров двух суспензий шариков в каждую пробную лунку предварительно увлажненного испытательного планшета. Пипетируйте по 50 микролитров каждой тестовой и контрольной сыворотки в тестовую пластину на основе заранее заданной карты планшета.

Закрепите крышку на тарелке. Накройте его алюминиевой фольгой и выдержите тестовую пластину в течение 60 минут на орбитальном вибростенде при комнатной температуре, чтобы избежать испарения растворов, которые могут помешать успешному проведению анализа. Держите тестовую пластину закрытой крышкой на всех этапах инкубации.

Кроме того, колебание скорости должно быть больше 400, но менее 700 оборотов в минуту, чтобы гранулы оставались во взвешенном состоянии, чтобы обеспечить антителам сыворотки доступ ко всем поверхностям связанных антигенов. После промывки пластины в последовательных инкубациях бусин с помощью BAG и SPE промыть образцы еще раз. Затем повторно суспендируйте бусины, добавив 125 микролитров пробы, промойте, буферизуйте и встряхните в течение двух минут, чтобы прочитать пластину.

Поместите его в пробирный считыватель в течение 10 минут после подвешивания бусин, бусины проходят по одной через детектор, где они подвергаются воздействию двух лазеров. Один лазер возбуждает внутренние красители, которые идентифицируют набор цветов шариков, а другой возбуждает краситель FICO. Интенсивность эритинговой флуоресценции FICO для заданного количества бусин сообщается по мере того, как FM FI считывает первую лунку, чтобы убедиться, что выбранная панель валика соответствует профилю валика в тестовых лунках.

Если на дисплее протокола есть валики, выходящие за пределы назначенной области валика, значит, был выбран неправильный профиль. Бусины, которые были должным образом ресуспендированы, заполнят указанные области, как указано в программном обеспечении пробирного ридера. Если бусины агрегированы, они будут заполнять свои области с медленной скоростью.

Вы можете снять тестовую пластину со считывателя и вручную подвешивать лунки для отделения шариков. Снимите тестовую пластину со считывателя и с помощью многоканального дозатора три-четыре раза обработайте каждую лунку. Затем верните тестовую пластину считывающему устройству и продолжайте изучать результаты.

Сообщите об ошибках, таких как недостаточное количество шариков или снижение показателей IgG против IgG, и повторите анализ для этих образцов. После экспорта данных в Excel и расчета чистого MFI определите, есть ли какие-либо из тестовых тестовых контрольных показателей, исключающие иммунную сыворотку высокого диапазона. Любые неудачные меры контроля недопустимы, и анализ необходимо повторить.

В этой таблице представлены данные для тестовой сыворотки и контрольного анализа из типичной пробирной пластины. Были ли пройдены все меры контроля IgG. Результаты тестов для этого месторождения показывают, что многочисленные тканевые реактивные и контрольные образцы IgG не помогли, как это видно в оранжевых лунках.

A1C 1 и F1 указывают на тканевую реактивную недостаточность TC, где оценка TC представлена в скобках, Wells B one и E 1 иллюстрируют два типа неудач внутреннего контроля IgG, недостаточное количество тестовых антител или тестовых реагентов, BAG или SPE соответственно. Результаты испытаний на планшете интерпретируются только в том случае, если контроль пригодности системы и контроль сыворотки соответствуют приведенным здесь критериям приемлемости. Микросферы, покрытые видоспецифичным антитестовым иммуноглобулином сыворотки, могут показывать неудовлетворительные результаты из-за слишком высокого уровня недостаточной пробы, разведения образца, неправильных видов или тестовой сыворотки от иммунодефицитного хозяина.

Если результаты контрольного теста удовлетворительны, индивидуальные баллы теста классифицируются в соответствии со следующим. Следуя этой процедуре, мы должны использовать дополнительные методы, такие как Элиза, ИФА и или вестерн-блоттинг, чтобы подтвердить первоначальные неожиданные или положительные результаты. Очень важно проверить эти результаты, прежде чем принимать какое-либо решение по содержанию животных.

Это можно сделать, используя разные методологии на одной и той же выборке или дополнительных образцах из одной и той же колонии. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проводить мультиплексный флюорограмму, метрический иммуноферментный анализ, а также интерпретировать результаты, полученные в вашем учреждении. Это позволит сократить трудозатраты и при этом получить больше информации из каждой тестовой скважины.