Мультиплексированный Флуорометрический Методология тестирования иммунологического анализа и устранение неисправностей

Общая цель следующего эксперимента заключается в выявлении антител к посторонним инфекционным агентам у лабораторных животных. Это достигается путем инкубации исследуемой сыворотки с микросферами, покрытыми антигеном. Затем сыворотка инкубируется со специфическими к виду антииммуноглобулинами, меченными биотином, которые определяют любые иммунные комплексы антиген-антитело.

Затем добавляется раствор FICO eryn Fluor force, меченный стрептавидином, для детектирования биотинилированных иммуноглобулинов; полученные результаты позволяют определить положительный или отрицательный статус антител к распространенным агентам у лабораторных грызунов на основе мультиплексной флуоресценции, итогового показателя иммуноанализа и значений флуоресценции образцов. Основным преимуществом использования данного метода по сравнению с существующими методами, такими как ELISA, является то, что MFIA представляет собой мультиплексный анализ. Это позволяет исследователю проводить до ста различных анализов в рамках одного теста.

Данный метод позволяет уменьшить объем используемых образцов сыворотки и расходных материалов по сравнению с существующими методами, одновременно увеличивая объем информации, получаемой в ходе одного анализа. Идея применения этого метода возникла у нас при тестировании большого количества образцов сыворотки на наличие множества агентов, когда возникла необходимость сократить трудозатраты и время проведения исследований. Процедуру продемонстрирует Донна Коэн, старший технолог нашей лаборатории. Для начала подготовьте два буферных раствора, необходимых для проведения мультиплексного флуоресцентного иммуноанализа (MFIA).

Первым является основной разбавитель, который можно приобрести у компании Charles River; он содержит запатентованные блокирующие агенты для снижения неспецифических взаимодействий в буфере для промывки при анализе. Приготовьте раствор PBS с 1%BSA pH 7.4 для удаления твердых частиц. Профильтруйте буфер через стерилизующий фильтр с размером пор 0.2 микрон в стерильные промаркированные контейнеры, используя буфер для промывки при анализе.

Приготовьте двухкратные концентрации биотинилированных антител к IgG или IgA и стрептавидина или SPE, которые будут использоваться для маркировки комплексов антиген-антитело, образовавшихся на этапе инкубации с тестовой сывороткой. Подготовьте следующие материалы и расходные принадлежности: многоканальные и одноканальные микропипетки с наконечниками, а также 96-луночные микротитрационные планшеты с низкой сорбцией белков для разведения белков. После забора проб крови и выделения сыворотки кратковременно перемешайте сыворотку на вортексе перед разведением образцов в первичном разбавителе в 96-луночном микротитрационном планшете. Чтобы обеспечить надлежащее и равномерное опорожнение лунок, предварительно увлажните каждую лунку 96-луночного тест-планшета промывочным буфером для анализа; в ходе проведения анализа медленно аспирируйте раствор.

Аспирацию следует проводить в течение 5–10 секунд, чтобы предотвратить агрегацию бусин и их уплотнение в фильтрующей мембране, так как оба этих фактора могут увеличить время считывания в конце анализа. Убедитесь, что слив жидкости прекратился, промокнув нижнюю сторону тест-планшета бумажными полотенцами. Важно промакивать тест-планшет после каждого этапа промывки, чтобы предотвратить вытягивание жидкости из лунок во время инкубации.

Для подготовки бусин начните с перемешивания стоковой суспензии конъюгированных бусин на вортексе. Затем подвергните их кратковременному воздействию ультразвука в ультразвуковой бане. Крайне важно правильно ресуспендировать бусины, чтобы предотвратить образование агрегатов, которые могут привести к увеличению времени считывания.

Затем разведите стоковую суспензию (20х) до рабочей концентрации (2х) в первичном разбавителе. После этого внесите по 50 µL суспензии микросфер (2х) в каждую лунку предварительно увлажненного тест-планшета. Добавьте по 50 µL каждой тестовой и контрольной сыворотки (2х) в лунки планшета в соответствии с заранее определенной схемой расположения образцов.

Плотно закройте планшет крышкой. Накройте его алюминиевой фольгой и инкубируйте тестовый планшет в течение 60 минут на орбитальном шейкере при комнатной температуре, чтобы избежать испарения растворов, которое может привести к неудаче анализа. На всех этапах инкубации держите тестовый планшет закрытым крышкой.

Кроме того, скорость встряхивания должна составлять от 400 до 700 RPM, чтобы бусины оставались во взвешенном состоянии, обеспечивая доступ антител сыворотки ко всем поверхностям конъюгированных антигенов. После промывки планшета в ходе последовательных инкубаций бусин с BAG и SPE повторно промойте образцы. Затем ресуспендируйте бусины, добавив 125 µL буфера для промывки и анализа, и встряхивайте в течение двух минут перед считыванием планшета.

Поместите образец в анализатор в течение 10 минут после ресуспендирования бусин; бусины по одной проходят через детектор, где они подвергаются воздействию двух лазеров. Один лазер возбуждает внутренние красители, которые определяют цветовой набор бусин, а другой возбуждает репортерный краситель FICO erything. Интенсивность флуоресценции FICO erything для заданного количества бусин регистрируется как значение FM FI; считайте первую лунку, чтобы убедиться, что выбранная панель бусин соответствует профилю бусин в тестовых лунках.

Если на дисплее протокола видны гранулы, выходящие за пределы назначенной области, значит, был выбран неправильный профиль. Гранулы, прошедшие надлежащее ресуспендирование, заполнят указанные области согласно показаниям программного обеспечения ридера. При агрегации гранул заполнение соответствующих областей будет происходить медленно.

Вы можете извлечь планшет с образцами из ридера и вручную ресуспендировать содержимое лунок для разделения микросфер. Извлеките планшет из ридера и с помощью многоканального дозатора трижды или четырежды пропипетируйте каждую лунку. Затем верните планшет в ридер и продолжите анализ результатов.

Сообщайте об ошибках, таких как недостаточное количество бусин или снижение показателей бусин IgG анти-IgG, и повторите анализ для этих образцов. После экспорта данных в Excel и расчета чистого MFI определите, прошел ли какие-либо из контролей анализа, за исключением иммунной сыворотки высокого диапазона. Любые неудовлетворительные результаты контролей неприемлемы, и анализ должен быть повторен.

В данной таблице представлены данные для тестовой сыворотки и контролей анализа с типичного планшета для анализа. Все контроли IgG прошли проверку. Результаты анализа для данного планшета указывают на то, что многочисленные образцы с тканевой реактивностью и контроли IgG не прошли проверку, что отмечено оранжевым цветом лунок.

A1C1 и F1 указывают на сбой реактивности ткани TC, где показатель TC приведен в скобках; Wells B1 и E1 иллюстрируют два типа сбоев внутреннего контроля IgG: недостаточное количество тестовых антител или тестовых реагентов, BAG или SPE соответственно. Результаты тестовой планшеты интерпретируются только в том случае, если контроль пригодности системы и контроль сыворотки соответствуют приведенным здесь критериям приемлемости. Микросферы, покрытые видоспецифичными иммуноглобулинами к тестовой сыворотке, могут демонстрировать неудовлетворительные показатели из-за добавления недостаточного объема образца, слишком высокого разведения образца, использования неправильного вида или тестирования сыворотки иммунодефицитного организма.

Если результаты контрольного анализа проб удовлетворительны, индивидуальные показатели анализа классифицируются следующим образом. После выполнения этой процедуры следует использовать дополнительные методы, такие как ELISA, IFA и/или вестерн-блоттинг, для подтверждения первоначальных неожиданных или положительных результатов. Крайне важно проверить эти результаты перед принятием любого решения по управлению поголовьем животных.

Это можно осуществить, применяя различные методологии к одному и тому же образцу или к дополнительным образцам из той же колонии. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить мультиплексный флуорометрический иммуноанализ и интерпретировать результаты, полученные в вашем учреждении. Это позволит вам снизить трудозатраты, получая при этом больше информации из каждой лунки с исследуемым образцом.