Пептидов и белков количественной оценки с использованием автоматизированных иммуно-MALDI (iMALDI)
18 августа 2017 г.
Представлен протокол для количественного определения белка в сложных биологических жидкостей, с использованием технологии автоматизированного иммуно MALDI (iMALDI).
Общая цель этого автоматизированного иммуно-MALDI-анализа заключается в точном и чувствительном количественном определении пептидов и интактных белков в сложных биологических жидкостях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области количественной протеомики, такие как количественная оценка уровней белка для диагностики или для мониторинга реакции пациента на лечение. Ключевое преимущество этого метода заключается в том, что он может очень чувствительно и точно количественно определять уровни белка из сложных образцов.
Этот метод позволяет диагностировать заболевания на ранней стадии, поскольку этап иммунообогащения позволяет количественно определить биомаркеры с низким содержанием белка и пептидов. Хотя этот метод может дать представление об активности ренина в плазме крови, он также может быть применен к другим исследованиям, связанным с заболеванием, таким как количественная оценка белков, связанных с раком, для прогноза, диагностики и управления лечением. Чтобы начать эту процедуру, разморозьте образцы плазмы человека на водяной бане комнатной температуры в течение пяти минут.
Затем поместите образцы на лед до полного оттаивания. Далее вручную перенесите 200 микролитров каждого образца плазмы в отдельные лунки луночной пластины глубиной 1,1 миллилитров. Центрифугируйте планшет в течение 10 минут при двух градусах Цельсия и 3 000 оборотах в минуту.
Затем используйте Bravo для последовательного разбавления 500 фемтомоле на микролитр стандартного раствора Ang-1 NAT для приготовления шести растворов калибратора с альбумином куриного яичного белка. После центрифугирования пипетку пипетку по 200 микролитров каждого калибратора в лунку и 125 микролитров буфера генерации в планшет для образца. Используя автоматизированную систему обработки жидкостей, смешайте 125 микролитров надосадочной жидкости плазмы или 125 микролитров раствора белка куриного яйца альбумина с 25 микролитрами буфера поколения ангиотензина I в новой луночной пластине объемом 1,1 миллилитров.
Теперь можно автоматически переносить растворы на 96-луночный планшет с тремя репликациями на раствор и 34 микролитрами раствора на лунку. Затем инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов. Для конъюгации антитела с гранулами белка G сначала перелейте 78 микролитров предварительно приготовленной суспензии в 1,5 миллилитровую пробирку.
Промойте бусины семь раз одним миллилитром 25% ацетонитрила в PBSC и три раза одним миллилитром PBSC, используя магнитную подставку для гранулирования бусин между каждой стиркой. После промывки бусин повторно суспендируйте их в 110 микролитрах PBSC и добавьте 110 микролитров антитела против ангиотензина I. Смешайте шарики и раствор с помощью пипетирования.
Затем инкубируйте бусины при комнатной температуре в течение одного часа, вращаясь со скоростью восемь оборотов в минуту. После этого трижды промыть бусины одним миллилитром PBSC. Затем повторно суспендируйте шарики в 1,100 микролитрах PBSC.
Теперь вручную перенесите раствор шариков на 96-луночный планшет. Затем попросите Bravo прикрепить бусины к той же 96-луночной пластине. После трехчасового периода генерации ангиотензина I поместите инкубационную пластину на лед на 10 минут, чтобы прекратить выработку ангиотензина I. Автоматически разбавьте стандартный стандарт стабильного изотопа пептидным стоковым раствором в 100 раз с PBS буфером.
Далее автоматически аликвотируется стандартное разведение пептида стабильного изотопа на 96-луночный ПЦР-планшет. Перенесите по 10 микролитров разведенного раствора пептида в каждую лунку инкубационной пластины. Смешайте разбавленный раствор пептида с образцами плазмы или раствором белка куриного яйца альбумина.
Автоматически добавьте образец или стандартные растворы в растворы гранул на инкубационную пластину и перемешайте. После инкубации в течение одного часа автоматически промойте бусины три раза пятимиллимолярным раствором бикарбоната аммония. С помощью магнита вытягивайте бусины на дно после каждой стирки.
После последней промывки добавьте по 10 микролитров раствора бикарбоната аммония в каждую лунку, чтобы повторно суспендировать шарики. Автоматически перенесите семь микролитров суспензии гранул на целевую пластину MALDI с размером пятна 2 600 микрометров. Как только шарики высохнут, автоматически добавьте два микролитра предварительно приготовленного матричного раствора HCCA из матричной лунки в каждое место образца на целевой пластине.
После этого проанализируйте места отбора проб с помощью прибора MALDI-TOF, используя режим положительного отражателя. Выполняйте внутреннюю калибровку, сглаживание данных и вычитание базовых линий с помощью программного обеспечения конкретного поставщика. Автоматизированная процедура измерения ангиотензина I iMALDI позволяет проводить высокопроизводительный анализ большого количества образцов с внутрисуточным коэффициентом вариации ниже 10%. Здесь представлены репрезентативные спектры, полученные при измерении ангиотензина I в образцах плазмы крови человека.
Здесь показана корреляция значений АФР из 188 образцов пациентов, полученных с помощью автоматизированного анализа iMALDI, со значениями ПРА, полученными с помощью клинической процедуры ЖХ-МС/МС. Эти два метода имеют коэффициент корреляции 0,98, а разница между наклонами может быть обусловлена использованием разных внутренних стандартов или разных антител. Здесь отображается линейный диапазон анализа и точность анализа.
После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за пять часов. Выполняя эту процедуру, не забудьте правильно отрегулировать головку наконечника и скорость работы с жидкостью. После этой процедуры могут быть использованы дополнительные методы для подтверждения первичного альдостеронизма у пациентов, включая пероральную солевую нагрузку или инфузию физиологического раствора.
Автоматизированный метод iMALDI позволяет проводить специфический и точный количественный скрининг биологических образцов, включая образцы пациентов, на наличие белков или пептидов, связанных с заболеванием. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выполнить автоматический анализ iMALDI для количественного определения белков и пептидов на основе масс-спектрометрии. Не стоит забывать, что работа с биологическими образцами, такими как плазма человека, крайне опасна, и при выполнении процедуры всегда необходимо соблюдать необходимые меры безопасности.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Эта статья представляет протокол для количественного определения пептидов и целостных белков в сложных биологических жидкостях с использованием автоматизированной иммуно-МАЛДИ (iMALDI) технологии. Метод разработан для обеспечения точных и чувствительных измерений, помогающих в диагностике и мониторинге лечения.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Протеомика
- Биологические анализы
- Диагностика
Фон
- Количественная протеомика необходима для понимания уровней белков в различных условиях.
- Низкоабундантные белковые и пептидные биомаркеры могут быть сложными для количественного определения.
- Ранняя диагностика заболеваний может значительно повлиять на результаты лечения.
- Автоматизированные методы увеличивают чувствительность и точность при количественном определении белков.
Цель исследования
- Разработать чувствительный и точный метод для количественного определения белков.
- Способствовать диагностике заболеваний на ранней стадии.
- Предоставить представление о рениновой активности плазмы и белках, связанных с раком.
Используемые методы
- Автоматизированная иммуно-МАЛДИ (iMALDI) технология.
- Шаг иммуно-обогащения для низкоабундантных белков.
- Разморозка образцов человеческой плазмы для анализа.
- Количественное определение белков и пептидов в сложных биологических жидкостях.
Основные результаты
- Метод позволяет чувствительное количественное определение белков из сложных образцов.
- Он может быть применен к различным исследованиям, связанным с заболеваниями.
- Ранняя диагностика заболеваний способствуется точному измерению белков.
- Можно получить представление о мониторинге лечения и ответе пациента.
Выводы
- Автоматизированная iMALDI технология является ценным инструментом в количественной протеомике.
- Метод улучшает возможности по ранней диагностике заболеваний.
- Он предоставляет базис для будущих исследований по количественному определению белков.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Automated immuno-MALDI (iMALDI) addresses the critical challenge of quantifying low-abundance peptide and protein biomarkers in complex biofluids, enabling sensitive detection in the ng/mL to pg/mL range required for clinical applications. By integrating immuno-enrichment with MALDI-TOF mass spectrometry and full automation, the method delivers high-throughput, reproducible quantification with intraday CV below 10%, supporting reliable biomarker measurement for diagnostic and therapeutic monitoring workflows. This capability enhances predictive confidence in target validation and assay development for cardiovascular, endocrine, and oncology indications where low-abundance analytes drive clinical decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying low-abundance peptides like angiotensin I in plasma, supporting functional validation of disease-relevant targets.
- Operational Value: Provides specific and accurate measurements from complex samples, reducing false negatives in biomarker detection and improving target confidence.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking through precise correlation with clinical readouts such as plasma renin activity, demonstrated by R=0.98 vs LC-MS/MS.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, mass-specific readouts via MALDI-TOF detection, enabling precise comparison of analyte levels across conditions and samples.
- Operational Value: Streamlines sample preparation through automation on liquid handling systems, improving reproducibility and throughput for large-scale screening campaigns.
- Assay Readiness: Eliminates elution steps, simplifying workflow and reducing hands-on time while maintaining sensitivity for low-abundance analytes in biofluids.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports alignment with clinical biomarkers like plasma renin activity, enabling translation from discovery to preclinical validation using disease-relevant concentration ranges.
- Risk-Adjusted Advancement: Delivers quantitative data with defined precision (CV<10%) and linearity, informing go/no-go decisions in lead optimization and preclinical candidate selection.
- Disease-Relevant System: Applicable to human plasma and other complex fluids, ensuring physiological relevance for cardiovascular, renal, and oncology biomarker studies.
Pipeline & Workflow Integration
The iMALDI method fits within the discovery continuum from early target validation through assay development to translational screening, providing quantitative protein and peptide measurements that inform lead identification and preclinical progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling sensitive quantification of signaling peptides and protein biomarkers in native biological matrices.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs with high reproducibility, facilitating reliable compound effect measurement in phenotypic or target-based screens.
- Analytics: Generates mass-resolved, quantitative readouts suitable for statistical comparison and correlation with functional or clinical endpoints.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through biomarker alignment, as demonstrated by angiotensin I quantification correlating with plasma renin activity in patient samples.
- Enterprise Reuse: Automated platform design allows reuse across multiple targets by changing antibody-bead conjugates, supporting scalable implementation in core proteomics laboratories.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through sensitive, specific detection of low-abundance analytes in disease-relevant samples.
- Operational Value: Standardization, reproducibility (CV<10%), and scalability via automation, reducing variability and increasing sample throughput.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by providing reliable biomarker data, reducing late-stage biological attrition and improving capital efficiency.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, translationally aligned measurements that reflect target engagement and pathway modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoassay design, antibody conjugation, and MALDI-TOF operation for successful implementation and troubleshooting.
- Dependent on liquid handling automation, magnetic bead separation systems, and MALDI-TOF instrumentation with reflector mode capability.
- Necessitates standardization across teams for reagent preparation, washing protocols, and matrix application to ensure inter-run consistency.
- Adaptation to new targets requires validation of antibody specificity, bead coupling efficiency, and interference testing in relevant biological matrices.
- Practical limitations include potential ion suppression in complex samples and the need for optimization of washing and elution-free transfer steps for each analyte-matrix pair.
