Пептидов и белков количественной оценки с использованием автоматизированных иммуно-MALDI (iMALDI)

Общая цель этого автоматизированного иммуно-MALDI-анализа заключается в точном и чувствительном количественном определении пептидов и интактных белков в сложных биологических жидкостях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области количественной протеомики, такие как количественная оценка уровней белка для диагностики или для мониторинга реакции пациента на лечение. Ключевое преимущество этого метода заключается в том, что он может очень чувствительно и точно количественно определять уровни белка из сложных образцов.

Этот метод позволяет диагностировать заболевания на ранней стадии, поскольку этап иммунообогащения позволяет количественно определить биомаркеры с низким содержанием белка и пептидов. Хотя этот метод может дать представление об активности ренина в плазме крови, он также может быть применен к другим исследованиям, связанным с заболеванием, таким как количественная оценка белков, связанных с раком, для прогноза, диагностики и управления лечением. Чтобы начать эту процедуру, разморозьте образцы плазмы человека на водяной бане комнатной температуры в течение пяти минут.

Затем поместите образцы на лед до полного оттаивания. Далее вручную перенесите 200 микролитров каждого образца плазмы в отдельные лунки луночной пластины глубиной 1,1 миллилитров. Центрифугируйте планшет в течение 10 минут при двух градусах Цельсия и 3 000 оборотах в минуту.

Затем используйте Bravo для последовательного разбавления 500 фемтомоле на микролитр стандартного раствора Ang-1 NAT для приготовления шести растворов калибратора с альбумином куриного яичного белка. После центрифугирования пипетку пипетку по 200 микролитров каждого калибратора в лунку и 125 микролитров буфера генерации в планшет для образца. Используя автоматизированную систему обработки жидкостей, смешайте 125 микролитров надосадочной жидкости плазмы или 125 микролитров раствора белка куриного яйца альбумина с 25 микролитрами буфера поколения ангиотензина I в новой луночной пластине объемом 1,1 миллилитров.

Теперь можно автоматически переносить растворы на 96-луночный планшет с тремя репликациями на раствор и 34 микролитрами раствора на лунку. Затем инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов. Для конъюгации антитела с гранулами белка G сначала перелейте 78 микролитров предварительно приготовленной суспензии в 1,5 миллилитровую пробирку.

Промойте бусины семь раз одним миллилитром 25% ацетонитрила в PBSC и три раза одним миллилитром PBSC, используя магнитную подставку для гранулирования бусин между каждой стиркой. После промывки бусин повторно суспендируйте их в 110 микролитрах PBSC и добавьте 110 микролитров антитела против ангиотензина I. Смешайте шарики и раствор с помощью пипетирования.

Затем инкубируйте бусины при комнатной температуре в течение одного часа, вращаясь со скоростью восемь оборотов в минуту. После этого трижды промыть бусины одним миллилитром PBSC. Затем повторно суспендируйте шарики в 1,100 микролитрах PBSC.

Теперь вручную перенесите раствор шариков на 96-луночный планшет. Затем попросите Bravo прикрепить бусины к той же 96-луночной пластине. После трехчасового периода генерации ангиотензина I поместите инкубационную пластину на лед на 10 минут, чтобы прекратить выработку ангиотензина I. Автоматически разбавьте стандартный стандарт стабильного изотопа пептидным стоковым раствором в 100 раз с PBS буфером.

Далее автоматически аликвотируется стандартное разведение пептида стабильного изотопа на 96-луночный ПЦР-планшет. Перенесите по 10 микролитров разведенного раствора пептида в каждую лунку инкубационной пластины. Смешайте разбавленный раствор пептида с образцами плазмы или раствором белка куриного яйца альбумина.

Автоматически добавьте образец или стандартные растворы в растворы гранул на инкубационную пластину и перемешайте. После инкубации в течение одного часа автоматически промойте бусины три раза пятимиллимолярным раствором бикарбоната аммония. С помощью магнита вытягивайте бусины на дно после каждой стирки.

После последней промывки добавьте по 10 микролитров раствора бикарбоната аммония в каждую лунку, чтобы повторно суспендировать шарики. Автоматически перенесите семь микролитров суспензии гранул на целевую пластину MALDI с размером пятна 2 600 микрометров. Как только шарики высохнут, автоматически добавьте два микролитра предварительно приготовленного матричного раствора HCCA из матричной лунки в каждое место образца на целевой пластине.

После этого проанализируйте места отбора проб с помощью прибора MALDI-TOF, используя режим положительного отражателя. Выполняйте внутреннюю калибровку, сглаживание данных и вычитание базовых линий с помощью программного обеспечения конкретного поставщика. Автоматизированная процедура измерения ангиотензина I iMALDI позволяет проводить высокопроизводительный анализ большого количества образцов с внутрисуточным коэффициентом вариации ниже 10%. Здесь представлены репрезентативные спектры, полученные при измерении ангиотензина I в образцах плазмы крови человека.

Здесь показана корреляция значений АФР из 188 образцов пациентов, полученных с помощью автоматизированного анализа iMALDI, со значениями ПРА, полученными с помощью клинической процедуры ЖХ-МС/МС. Эти два метода имеют коэффициент корреляции 0,98, а разница между наклонами может быть обусловлена использованием разных внутренних стандартов или разных антител. Здесь отображается линейный диапазон анализа и точность анализа.

После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за пять часов. Выполняя эту процедуру, не забудьте правильно отрегулировать головку наконечника и скорость работы с жидкостью. После этой процедуры могут быть использованы дополнительные методы для подтверждения первичного альдостеронизма у пациентов, включая пероральную солевую нагрузку или инфузию физиологического раствора.

Автоматизированный метод iMALDI позволяет проводить специфический и точный количественный скрининг биологических образцов, включая образцы пациентов, на наличие белков или пептидов, связанных с заболеванием. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выполнить автоматический анализ iMALDI для количественного определения белков и пептидов на основе масс-спектрометрии. Не стоит забывать, что работа с биологическими образцами, такими как плазма человека, крайне опасна, и при выполнении процедуры всегда необходимо соблюдать необходимые меры безопасности.