Запись синаптической пластичности в острой гиппокампа ломтики в малообъемной рециркуляции-, перфузии и погружения типа камерная система

Общая цель данной методики состоит в том, чтобы предложить способ обеспечения упрощенных способов карбогенизации малообъемных рециркуляционных АКСП и достижения долговременных регистров потенциалов поля с помощью регистрирующей камеры, установленной на флуоресцентном микроскопе. Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы в области нейропластичности, связанные с лежащими в основе лигниновыми путями, которые регулируют синаптическую передачу и формирование памяти в клеточном режиме обучения и памяти. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он помогает стабилизировать уровень кислорода в небольшом биорезервуаре для повышения экономической эффективности экспериментов с использованием конкретных антагонистов или агонистов.

Приготовление острых срезов гиппокампа продемонстрировали аспиранты Ся и Вэйгуан из нашей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, с помощью холодного хирургического лезвия рассеките участок дорсальной коры под углом 70 градусов вдоль дорсального края каждого полушария. С помощью холодного шпателя из стоматологического цемента перенесите каждую полусферу на лист фильтровальной бумаги, чтобы ненадолго подсушить поверхность.

Закрепите две полусферы со свежевырезанными поверхностями на платформе для ледяной нарезки с помощью быстродействующего клеевого клея так, чтобы хвостовой конец полусфер был обращен к лезвию бритвы. Затем поместите платформу для нарезки в охлаждающую камеру вибратома. Заполните камеру буфером для нарезки при температуре от двух до четырех градусов Цельсия и карбогенизируйте его.

После этого нарежьте ломтики на 350 микрометров с использованием адекватных настроек вибротома. Изолируйте образование гиппокампа от субикулума и энторинальной коры с помощью двух инъекционных канюль в качестве ножниц. Удалите пузырьки из срезоудерживающей сетки заранее подготовленной инкубационной камеры с помощью пастеровской пипетки.

Затем переложите ломтики, которые имеют некоторую прозрачность в пирамидальном слое, с платформы для нарезки на сетку инкубационной камеры с помощью пипетки Пастера с большим горлышком. На этом этапе добавьте трехконтактный соединитель трубки к выходу системы переработки. Подсоедините средний рычаг трехходового соединителя трубки к подающей трубке карбогена и отрегулируйте расход с помощью расходомера.

После этого добавьте второй трехходовой соединитель трубки к притоку системы переработки. Подсоедините средний рычаг к трубке, обращенной к встроенному нагревателю, верхний рычаг — к тонкой силиконовой трубке, а нижний рычаг — к входной трубке из резервуара. Затем поместите соковыжималку для трубок на тонкую силиконовую трубку в положение вдоль трубки, где пульсация ACSF в камере среза, создаваемая перистолическим насосом, минимальна.

Теперь предварительно замочите небольшой кусочек бумаги для чистки линз и нейлоновую сетку, закрепленную на U-образной платиновой проволоке, в камере для погружения на несколько минут. После этого снимите-образную платиновую проволоку. Выключите переработку и положите ломтик на бумагу для чистки объектива.

Затем сразу же поместите сетку для удержания среза поверх среза. Включите насос и дайте срезу уравновеситься в течение 30 минут, не опуская объектив в ACSF. Тем временем заполните записывающий электрод ACSF и установите его в держатель пипетки.

Проверьте изоляцию металлического электрода для стимуляции, поместив его в раствор гидрокарбоната натрия. Подсоедините электрод к отрицательному полюсу генератора постоянного напряжения и понаблюдайте за образованием пузырьков на кончике под микроскопом вскрытия. Затем поместите испытуемый вольфрамовый электрод с апоксидной изоляцией в держатель манипулятора, а провод сравнения — в камеру среза.

Добавьте второй электрод сравнения в камеру и подсоедините его к контрольному гнезду головного столика записывающего электрода. В программном обеспечении для управления усилителем нажмите на поле режима нулевого зажима, затем дважды щелкните на поле со списком выходного усиления. Выберите коэффициент усиления 100, дважды щелкните по резервуару фильтра высоких частот, выберите три килогерца и дважды щелкните по блоку фильтра низких частот AC, чтобы выбрать 0,1 герца.

В программном обеспечении для записи нажмите «Получить», откройте протокол. Выберите протокол, который имеет настройки, позволяющие проводить эпизодическую стимуляцию и оцифровку усиленных потенциалов на частоте от 10 до 20 килогерц в течение 50-100 миллисекунд и который автоматически запускает изолятор стимулов через 10 миллисекунд после начала эпизодической записи. Электроды для стимуляции и записи расположите на одной линии и параллельно пирамидальному слою.

Затем нажмите «Получить», отредактируйте протокол и выберите вкладку триггера во всплывающем окне. Нажмите на поле источника триггера и выберите пробел в качестве источника триггера. Затем нажмите кнопку «ОК» и нажмите кнопку «Запись», чтобы начать сбор данных.

В программном обеспечении изолятора стимулов нажмите на поле управления напряжением и введите ноль. Нажмите кнопку загрузки. После этого нажмите на окно программы записи и нажмите пробел.

Повторите этот цикл, последовательно вводя значения от 1000 до 8000. Соотнесите силу воздействия со значениями наклона FEPSP и определите необходимую силу воздействия для получения 40% от максимального значения наклона FEPSP. Щелкните по окошку управления напряжением и введите определенное значение.

Затем нажмите кнопку загрузки. В программном обеспечении для записи нажмите кнопку «Стоп», а затем меню «Захват». Нажмите «Редактировать протокол» и выберите вкладку триггера во всплывающем окне.

После этого нажмите на поле источника триггера и выберите внутренний таймер в качестве источника триггера. Нажмите кнопку OK, а затем кнопку записи, которая запускает автоматическую запись потенциалов поля каждые 60 секунд. Нажмите кнопку «Стоп» через 30-60 минут.

В программном обеспечении для записи нажмите кнопку «Получить», «Открыть протокол» и выберите тот же протокол, что и для базовой записи. Нажмите кнопку «ОК», а затем нажмите «Запись». Продолжайте автоматически запускать полевые потенциальные записи в течение двух-четырех часов.

Когда она будет завершена, нажмите кнопку «Стоп», чтобы прервать запись. На этом рисунке представлены репрезентативные записи активно-зависимого потенцирования синаптической передачи с использованием карбогенации оттока и карбогенации резервуара с рециркуляцией небольшого резервуара ACSF. Потенцирование индуцировалось после нулевой точки времени в три раза быстрее по 100 герц в секунду.

На этом рисунке показано, что карбогенация на выходе с рециркуляцией небольшого резервуара ACSF улучшила индукцию LTD по сравнению с экспериментами только с карбогенацией резервуара. После освоения подготовка среза может быть выполнена за 5-10 минут, а стабильная регистрация потенциала поля также может быть достигнута в течение многих часов, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно отрегулировать уровень карбогенации, скорость перфузии, положение электродов и напряжение стимуляции вашей конкретной эквивалентности.

Следуя этой процедуре, можно провести другой метод, такой как пластырь, криминалистическую микроскопию, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как вирилизация клеточной локализации сока зондирования равина в ответ на индукцию активности-зависимой синаптической пластичности. После своего развития этот метод открывает исследователям в области нейропластичности путь к изучению зависимой от активности синаптической пластичности как клеточного способа обучения и памяти в in vitro срезах гиппокампа генов well tab и трансгенных мышиных генов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выполнять подготовку острого среза из височного гиппокампа и как получить стабильные условия для длительной регистрации синаптических передач с использованием небольшого объема переработанного ACSF.

Не забывайте, что работа с животными и химическими соединениями может быть опасной, поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и надлежащая дезинфекция.