Исследование Synaptic Tagging / Захват и кросс-захвата с помощью острой срезах гиппокампа от грызунов

Общая цель данной процедуры заключается в изучении долгосрочной пластичности и связанных с ней ассоциативных процессов, таких как синаптическая маркировка, захват и перекрестная маркировка в пирамидных нейронах области CA1 гиппокампа на срезах гиппокампа грызунов. Для этого сначала проводят диссекцию головного мозга и быстрое выделение гиппокампа в охлажденную оксигенированную искусственную цереброспинальную жидкость. Вторым этапом является приготовление острых срезов гиппокампа с помощью ручного томографа (слайсера тканей) и их инкубация в интерфейсной камере.

Следующие два стимулирующих и два регистрирующих электрода помещают в область CA1 для регистрации полевых EPSP и ответов популяционного спайка от двух синаптических входов. Заключительным этапом является индукция кратковременной формы пластичности на одном синаптическом входе и стойкой формы пластичности на другом входе в определенном временном окне. В конечном итоге регистрируются полевые EPSP от обоих входов в течение длительного времени для исследования механизмов захвата синаптических меток (synaptic tagging capture) и перекрестного захвата (cross capture).

Синаптическое мечение и захват обеспечивают концептуальную основу того, как кратковременная память преобразуется в долговременную в течение определенного промежутка времени. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как экспериментальные этапы трудно освоить, поскольку они включают стимуляцию и регистрацию сигналов от множества синаптических входов. Процедуру продемонстрируют Махеш Шира, machete и maima Sharma, аспиранты моей лаборатории.

Для начала данной процедуры подготовьте искусственную спинномозговую жидкость (A CSF) и продуйте ее смесью 95% oxygen и 5% carbon dioxide. Заполните нижнюю часть интерфейсной камеры дистиллированной водой примерно на 70% ее объема. Затем включите контроллер температуры, предварительно установив значение 32 °C.

Затем промойте верхнюю камеру в течение 10–15 минут, пропуская дистиллированную воду через входной шланг с высокой скоростью потока, после чего переключитесь на A CSF со скоростью потока 1 мл/мин. Затем поместите сетку в верхнюю камеру, чтобы создать поверхность для размещения срезов. Начните барботирование нижнюю камеру карбогеном; погрузите входной шланг в A CSF, который подвергается непрерывному барботированию карбогеном.

Подождите 20 минут, чтобы A CSF насытился карбогеном и заполнил верхнюю камеру. На этом этапе установите лезвие бритвы в тканевый резак и убедитесь, что режущая кромка выровнена равномерно. Проверьте надежность закрепления лезвия, разрезав небольшой кусочек фильтровальной бумаги.

Затем установите скользящий штангенциркуль в исходное положение. Теперь возьмите голову эвтаназированной крысы и с помощью ирисных ножниц сделайте разрез через заднюю часть черепа, чтобы удалить ствол головного мозга. Затем сделайте небольшой разрез вдоль правой стороны черепа и более длинный разрез слева.

Осторожно удалите череп с помощью костного UR, двигаясь от левой стороны к правой стороне черепа. Чтобы обнажить кору и покрывающий ее тонкий слой твердой мозговой оболочки, осторожно удалите твердую оболочку тонким шпателем, а затем удалите лобные пластинки с помощью bone Ro. После этого удалите оставшуюся твердую оболочку, особенно в области соединения коры и мозжечка, плоским концом шпателя, избегая повреждения мозга за счет поддержания давления, направленного вверх.

С помощью шпателя аккуратно перенесите мозг в чашку Петри, помещенную на алюминиевый охлаждающий блок с холодным карбонизированным A CSF. Чтобы изолировать гиппокамп, используя скальпель № 11, сделайте прямой разрез для удаления мозжечка и еще один разрез, чтобы удалить одну четверть передней части мозга. Затем сделайте неглубокий сагиттальный разрез вдоль срединной линии. Начиная от срединной линии.

Осторожно удалите кору с помощью серповидного скалера, чтобы обнажить дорсальный гиппокамп. После этого удалите слой коры, расположенный над гиппокампом. Сделайте небольшой разрез в области комиссуры гиппокампа.

Осторожно извлеките гиппокамп с помощью серповидного скалера, начиная с дорсального конца вращательными движениями. Затем удалите остатки коры и соединительных тканей вокруг изолированного гиппокампа, используя изогнутый конец скалера. Чтобы нарезать ткань гиппокампа, поместите кусочек 30-миллиметровой фильтровальной бумаги Watman, смоченной в ЦСЖ, на платформу для нарезки ручного микротома.

Перенесите ткань гиппокампа на фильтровальную бумагу. С помощью плоского конца серповидного скальпеля переместите фильтровальную бумагу так, чтобы гиппокамп был ориентирован правильно относительно лезвия слайсера, чтобы срез гиппокампа проходил под углом примерно 70 градусов к fia. Затем удалите излишки раствора вокруг ткани гиппокампа с помощью фильтровальной бумаги.

С помощью сложенной фильтровальной бумаги выполните поперечные срезы гиппокампа, удаляя ткани с крайнего конца гиппокампа, где морфология среза недостаточно четкая. Затем нарежьте оставшуюся ткань на срезы толщиной 400 micron, регулируя штангенмикрометр после каждого цикла нарезки. После каждого разреза аккуратно перенесите срез с лезвия кистью с мягким ворсом в небольшой стакан с холодным карбонизированным A CSF.

Затем осторожно перенесите срезы на сетку в камере для срезов с помощью чистой пластиковой пастеризованной пипетки. С помощью широкого наконечника аккуратно отрегулируйте положение срезов так, чтобы облегчить установку электродов и проверку записи, убедившись, что срезы достаточно окружены слоем A CSF, но не погружены в него полностью. После этого закройте камеру и инкубируйте срезы в течение двух-трех часов для экспериментов по синаптическому тегированию и захвату.

Под микроскопом расположите два стимулирующих электрода в stratum radiatum области CA1 для стимуляции коллатералей Шаффера и регистрирующий электрод в области апикальных дендритов CA1 посередине между стимулирующими электродами. Для регистрации ответов fEPSP поместите еще один регистрирующий электрод в слой stratum pyramidale для записи популяционного спайка.

Когда все электроды коснутся среза, подайте тестовую стимуляцию, чтобы убедиться в возможности получения надлежащего сигнала полевого ВПСП на обоих входах. После получения подходящего сигнала ВПСП осторожно опустите электроды еще примерно на 200 microns, используя винты точной подачи манипуляторов. Затем дайте срезу восстановиться в течение 20 минут.

После этого определите зависимость «вход-выход», измеряя наклон полевого EPSP при диапазоне интенсивностей тока от 20 microamps до 100 microamps. Затем для каждого входа установите интенсивность стимуляции, вызывающую 40% от максимального наклона полевого EPSP, в качестве постоянного стимула на протяжении всего эксперимента. Через 15–20 минут начните регистрацию; запишите стабильную базовую линию в течение минимум 30–60 минут перед индукцией L-T-P-L-T-D на одном входе, затем индуцируйте раннюю LTP, используя слабый протокол тетанизации, состоящий из одной высокочастотной стимуляции.

В то время как другой вход продолжает регистрировать базовую линию через 30 минут после индукции ранней LTP, индуцируйте позднюю LTP во втором входе S, используя протокол сильной тетанизации, включающий повторную высокочастотную стимуляцию с интервалом между сериями 10 минут. Затем регистрируйте ответы полевых EPSP в течение длительного времени, чтобы выявить трансформацию ранней LTP в первом входе S в позднюю LTP за счет синаптического тегирования и захвата. Аналогично, в эксперименте по перекрестному захвату сначала индуцируйте раннюю LTP в одном входе, после чего через 30 минут проведите индукцию поздней LTD в другом входе, используя протокол сильной низкочастотной стимуляции, состоящий из 900 пачек в течение 15 минут.

Затем зарегистрируйте ответы полевых возбуждающих постсинаптических потенциалов (ПСП) в течение длительного времени, чтобы зафиксировать трансформацию ранней долгосрочной потенциации (ДСП) вに入ходе S1 в позднюю ДСП за счет перекрестного захвата. В данной схеме два стимулирующих электрода расположены в радиальном слое (stratum radiatum) области CA1 для стимуляции двух независимых, но перекрывающихся синаптических входов. Два внеклеточных регистрирующих электрода установлены на пирамидальные нейроны области CA1.

Один электрод используется для регистрации f-EPSP в апикальном дендритном компартменте, а другой — для регистрации соматического популяционного спайка от тел параметальных клеток, расположенных в stratum radiatum и stratum pyramidale соответственно. На этом рисунке представлена парадигма «слабый-перед-сильным» для изучения синаптической маркировки и захвата.

Слабая тетанизация применяется к S one для индукции ранней LTP, за которой следует сильная тетанизация S two через 30 минут для индукции поздней LTP; на данном рисунке показана схема «слабая стимуляция перед сильной парадигмой» для изучения перекрестного тегирования. Ранняя LTP индуцируется слабой тетанизацией в S one, после чего в S two индуцируется поздняя LTD с использованием протокола сильной низкочастотной стимуляции. Через 30 минут в S one ранняя LTP трансформируется в позднюю LTP продолжительностью шесть часов, что демонстрирует перекрестное тегирование и захват.

После освоения данная техника диссекции и приготовления срезов может быть выполнена очень быстро, в течение трех-пяти минут. Таким образом, жизнеспособность срезов может быть сохранена для длительных записей. Используя этот метод, можно также изучить влияние различных фармакологических агентов на процессы синаптического маркирования и захвата.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить эксперименты по изучению долгосрочной функциональной пластичности, а также о процессах синаптического мечения и захвата.