Исследование Synaptic Tagging / Захват и кросс-захвата с помощью острой срезах гиппокампа от грызунов

Общая цель этой процедуры заключается в изучении долгосрочной пластичности и ее ассоциативных процессов, таких как синаптическое мечение, захват и перекрестное мечение в нейронах параметалла CA one с использованием Q срезов гиппокампа грызунов. Это достигается путем препарирования мозга и быстрой изоляции гиппокампа в холодную искусственную спинномозговую жидкость, насыщенную кислородом. Второй шаг заключается в подготовке острых срезов гиппокампа с помощью ручного тканевого среза и их инкубации в интерфейсной камере.

Затем два стимулирующих электрода и два записывающих электрода помещаются в одну область CA для регистрации полевого EPSP и популяционных спайковых откликов с двух синаптических входов. Последний шаг состоит в том, чтобы вызвать преходящую форму пластичности в одном синаптическом входе и устойчивую форму пластичности в другом входе в течение определенного временного окна. В конечном счете, полевые ответы EPSP с обоих входов записываются в течение длительного времени для исследования механизмов захвата синаптических тегов и перекрестного захвата.

Синаптическая маркировка и захват обеспечивают концептуальную основу для того, как кратковременная память преобразуется в долговременную память в течение определенного периода времени. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку экспериментальные шаги трудно освоить, поскольку они включают стимуляцию и запись с нескольких синаптических входов. Демонстрировать процедуру будут Махеш Шира, мачете и аспиранты Маймы Шарма из моей лаборатории.

Чтобы начать эту процедуру, приготовьте ликвор и наполните его 95% кислорода и 5% углекислого газа. Заполните дно интерфейсной камеры дистиллированной водой примерно на 70% от ее емкости. Затем включите регулятор температуры, установленный на 32 градуса Цельсия.

Затем промойте верхнюю камеру в течение 10-15 минут, пропустив дистиллированную воду через входную трубку с высокой скоростью потока, прежде чем переключиться на A CSF со скоростью потока один миллилитр в минуту. Затем поместите сетку в верхнюю камеру, чтобы обеспечить поверхность для отдыха ломтиков. Начните карбоген с нижней камеры, погрузите входную трубку в спинномозговую жидкость, которая непрерывно карбогенится.

Подождите 20 минут, чтобы спинномозговая жидкость пропиталась карбогеном и заполнила верхнюю камеру. На этом этапе установите лезвие бритвы на измельчитель тканей и убедитесь, что режущая кромка равномерно выровнена. Проверьте это, нарезав небольшую фильтровальную бумагу, чтобы убедиться, что лезвие надежно закреплено.

Затем установите скользящий нониусный микрометр в исходное положение. Теперь достаньте голову усыпленной крысы и с помощью ножниц по радужной оболочке глаза сделайте надрез через заднюю часть черепа, чтобы удалить ствол мозга. Затем сделайте небольшой разрез вдоль правой стороны черепа и более длинный разрез слева.

Осторожно удаляют череп с помощью кости УР, начиная с левой стороны и переходя к правой стороне черепа. Чтобы выявить кору головного мозга и покрывающий ее тонкий слой твердой мозговой оболочки, осторожно удалите твердую мозговую оболочку тонким шпателем, а затем удалите лобные пластины вместе с костью. Впоследствии, удалите оставшуюся твердую мозговую оболочку в месте соединения между корой головного мозга и мозжечком с помощью плоского конца шпателя и избегайте повреждения мозга, поддерживая давление вверх.

Используя шпатель, аккуратно зачерпните мозг в чашку Петри на алюминиевом охлаждающем блоке, наполненном холодной и газированной спинномозговой жидкостью, чтобы изолировать гиппокамп с помощью скальпеля под номером 11, сделайте прямой разрез для удаления мозжечка и еще один разрез для удаления одной четверти передней части мозга. Затем сделайте неглубокий сагиттальный надрез по средней линии. Начиная от средней линии.

Осторожно удалите кору головного мозга с помощью серповидного скалера, чтобы открыть дорсальный гиппокамп. После этого удаляют слой коры над гиппокампом. Сделайте небольшой надрез до комиссуры гиппокампа.

Аккуратно удалите гиппокамп с помощью серповидного скалера, начиная с дорсального конца перекатывающими движениями. Впоследствии удалите всю кору и соединительные ткани вокруг изолированного гиппокампа с помощью изогнутого конца серповидного скалера. Чтобы разрезать ткань гиппокампа, положите кусок 30-миллиметровой фильтровальной бумаги Ватмана, пропитанной спинномозговой жидкостью, на ступень нарезки ручного слайсера.

Перенесите ткани гиппокампа на фильтровальную бумагу. Используя плоский конец серповидного скалора, переместите фильтровальную бумагу, чтобы выровнять гиппокамп в правильной ориентации по отношению к лезвию слайсера, так, чтобы гиппокамп был разрезан под углом около 70 градусов к fia. Далее промокните излишки раствора, окружающие ткани гиппокампа.

С помощью сложенной фильтровальной бумаги разрежьте гиппокамп поперечно и отбросьте ткань с крайнего конца гиппокампа, где морфология среза не ясна. Затем нарежьте оставшуюся ткань на ломтики толщиной 400 микрон, регулируя нониусный микрометр после каждого раунда нарезки. После каждого надреза аккуратно перекладывайте ломтик с лезвия с помощью щетки с мягкой щетиной на небольшой стакан, наполненный холодным газированным ликвором.

Затем аккуратно переложите ломтики на сетку в камере для нарезок с помощью чистой пластиковой пипетки. С помощью широкого наконечника осторожно отрегулируйте положение срезов таким образом, чтобы облегчить расположение электродов и проверку записи, чтобы убедиться, что срезы достаточно окружены слоем ликвора, но не полностью погружены в воду. После этого накройте камеру крышкой и инкубируйте срезы в течение двух-трех часов в экспериментах по синаптическому мечению и захвату.

Под микроскопом два стимулирующих электрода располагают в слое ради-атома СА в одной области для стимуляции коллатеральных волокон Шаффера, а при регистрации электрода в апикальной дендритной области примерно на полпути между стимулирующими электродами. Чтобы записать отклики F-E-P-S-P, поместите еще один записывающий электрод в слой parid. Слой DO для записи всплеска населения.

Когда все электроды касаются среза, проведите тестовую стимуляцию, чтобы убедиться, что на обоих входах может быть получен сигнал EPSP соответствующего поля. Как только будет получен правильный сигнал F-E-P-S-P, осторожно опустите электроды еще на 200 микрон, используя ручки тонкого движения манипуляторов. Затем подождите 20 минут, чтобы ломтик восстановился.

После этого определите отношение выходного сигнала на входе, измерив наклон EPSP поля в диапазоне интенсивностей тока от 20 мкА до 100 мкАмпер. Затем для каждого входного сигнала установите интенсивность стимуляции, которая вызывает 40% от максимального наклона EPSP поля в качестве постоянного стимула на протяжении всего эксперимента. Через 15-20 минут начните записывать стабильную базовую линию за не менее 30-60 минут до индукции L-T-P-L-T-D на одном входе, индуцируйте раннюю LTP с помощью слабого протокола тетина, состоящего из одной высокочастотной стимуляции.

В то время как другой входной сигнал продолжает регистрировать исходный уровень через 30 минут после ранней индукции LTP, индуцируйте поздний LTP на входе S два, используя протокол сильного тетина, включающий повторяющуюся высокочастотную стимуляцию с интервалом между тренировками в 10 минут. Затем запишите ответы EPSP в поле на расширенные до длительностей, чтобы выявить трансформацию раннего LTP на входе S one к позднему LTP с помощью синаптической маркировки и захвата. Аналогично, в эксперименте по перекрестному захвату сначала индуцируют ранний LTP и один вход, а через 30 минут — позднюю индукцию LTD на другом входе, используя сильный протокол низкочастотной стимуляции, состоящий из 900 всплесков в течение 15 минут.

Затем запишите ответы EPSP на поле в течение длительного времени, чтобы выявить преобразование раннего LTP на входе S one в поздний LTP с помощью перекрестного захвата. На этом изображении два стимулирующих электрода расположены в слое radi атома CA one area для стимуляции двух независимых, но перекрывающихся синаптических входов. На КА один параметаллический нейрон два внеклеточных записывающих электрода.

Один из них регистрирует F-E-P-S-P из апикального дендритного компартмента. И еще один, чтобы зафиксировать всплеск соматической популяции от тел клеток параметалла, расположенных в слое radi atom и stratum para соответственно. На этом рисунке показана неделя до начала сильной парадигмы изучения синаптической маркировки и захвата.

Слабый тетин применяется к S-единице для индуцирования ранней LTP, за которым следует сильный тетин S-2 через 30 минут для индуцирования поздней LTP, и этот рисунок показывает неделю до сильной парадигмы для изучения перекрестного мечения. Ранняя ЛТП индуцируется слабым тетином в S-единице, за которой следует индукция поздней ЛТД в S-2 с использованием сильного протокола низкочастотной стимуляции. Через 30 минут в первом случае ранний LTP преобразуется в поздний LTP продолжительностью шесть часов, показывая перекрестное тегирование и захват.

После освоения эта техника рассечения и подготовки среза может быть выполнена очень быстро в течение трех-пяти минут. Таким образом, жизнеспособность срезов может быть сохранена для длительной записи. Используя этот метод, можно также проверить влияние различных фармакологических агентов на процессы синаптического мечения и захвата.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить долгосрочные эксперименты по функциональной пластичности и процессам синаптической маркировки и захвата.