Последовательность конкретных и избирательное признание двуцепочечной РНК над одноцепочечной РНК, химически изменены пептид нуклеиновых кислот

Общая цель данной статьи по методологии — представить детальные протоколы, используемые в нашей лаборатории для изучения молекулярного распознавания двухцепочечных РНК химически модифицированными пептидными нуклеиновыми кислотами. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области химической биологии РНК, такие как детектирование и таргетирование структур РНК. Основным преимуществом данной техники является то, что принципы дизайна могут быть применимы для таргетирования любых дуплексных структур РНК.

Процедуру продемонстрирует Desiree Toh, научный сотрудник моей лаборатории. Для начала процедуры добавьте 4 µL 35% раствора глицерина к предварительно подготовленным образцам РНК-ПНА и осторожно перемешайте. С помощью микропипетки и наконечников для нанесения на гель аккуратно внесите 20 µL каждого образца в предварительно подготовленный полиакриламидный гель, стараясь не допустить появления пузырьков воздуха.

Проводите электрофорез геля при постоянном напряжении 250 вольт в течение пяти часов. По истечении пяти часов выключите источник питания и извлеките стеклянную пластину из держателя для геля. Затем снимите герметизирующую ленту и разберите стеклянную пластину.

Осторожно извлеките гель со стеклянной пластины и поместите его в контейнер, наполненный 350 milliliters деионизированной воды. Осторожно добавьте в контейнер 35 microliters бромистого этидия и поместите его на платформенную шейкер-платформу на низкую скорость на 30 minutes. После утилизации раствора бромистого этидия промойте гель от 1.5 до двух liters дистиллированной воды.

Затем просканируйте гель с помощью имиджера с зеленым лазером с длиной волны 532 нанометров и эмиссионным фильтром, настроенным на 610 нанометров. Количественно определите интенсивность полос геля, используя бесплатное программное обеспечение. Перенесите соответствующее количество двухцепочечной РНК, меченной 2-аминопурином, в чистую пробирку объемом 1,5 миллилитра.

Затем сконцентрируйте растворы РНК с помощью вакуумного концентратора. Далее перенесите из ранее приготовленного основного стока соответствующие объемы целевого PNA для получения различных концентраций в отдельные пробирки объемом 1,5 миллилитра. Сконцентрируйте растворы PNA с помощью вакуумного концентратора.

Добавьте 975 мкл инкубационного буфера в пробирку с высушенной РНК и тщательно перемешайте, чтобы полностью растворить РНК. После кратковременного центрифугирования раствора РНК проведите отжиг, поместив пробирку в предварительно нагретый термоблок на 10 минут. По завершении выключите термоблок и дайте образцу остыть до комнатной температуры.

Добавьте 75 microliters РНК в каждую из пробирок с высушенным PNA и тщательно перемешайте. После выдержки образцов при комнатной температуре в течение не менее одного часа инкубируйте их при температуре четыре degrees Celsius в течение ночи. Затем перенесите соответствующие количества одноцепочечной РНК, меченной 2-аминопурином, в отдельные пробирки объемом 1.5 milliliter.

Перенесите соответствующие объемы целевого PNA для различных концентраций из основного стока в соответствующие пробирки, содержащие одноцепочечную РНК. После высушивания образцов добавьте в каждую пробирку 75 µL инкубационного буфера и тщательно перемешайте. Проведите отжиг каждого образца, поместив пробирки в предварительно нагретый термоблок на 10 минут.

После охлаждения образцов до комнатной температуры инкубируйте их при температуре 4 °C в течение ночи. Затем перенесите по 70 µL каждого образца в кювету с длиной стороны 1 см. Поместите кювету в флуоресцентный спектрофотометр и измерьте эмиссию в диапазоне длин волн от 330 до 550 нм.

После завершения измерения удалите буфер из кюветы. Промойте кювету дистиллированной водой и высушите потоком азота. Повторив измерение для всех образцов, постройте график зависимости интенсивности флуоресценции от длины волны.

Перенесите соответствующие количества одноцепочечной РНК в отдельные пробирки объемом 1,5 мл. Затем перенесите соответствующие объемы целевого PNA из основного запаса в соответствующие пробирки с одноцепочечной РНК. После высушивания образцов добавьте в каждую пробирку 130 µL инкубационного буфера и тщательно перемешайте.

Проведите отжиг каждого образца, поместив каждую пробирку в предварительно нагретый термоблок на 10 минут. После охлаждения образцов до комнатной температуры инкубируйте их при температуре 4 °C в течение ночи. Затем перенесите 130 µL каждого образца в кювету на восемь микроячеек, при этом одна ячейка должна содержать инкубационный буфер.

С помощью УФ-видимого спектрофотометра измерьте абсорбцию каждого образца при 260 нанометрах. Проведите измерения при повышении температуры от 15 до 95 °C, а затем при понижении температуры от 95 до 15 °C со скоростью нагрева/охлаждения 0,5 °C в минуту. Олигомеры ПНК были получены после двух этапов очистки методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Идентичность ПНК может быть подтверждена методом MALDI-TOF анализа. Данные недентурирующего электрофореза в ПААГ свидетельствуют о том, что ПНК, модифицированные Q и L, способны распознавать двухцепочечный участок РНК только в присутствии пары C-G. Это специфическое и усиленное распознавание происходит за счет образования двухбазовых триплексов ПНК-РНК T-A-U-L-G-C и Q-C-G.

Исследование флуоресцентного титрования с использованием 2-аминопурина показало, что модифицированные Q и L ПНА связываются с целевой двухцепочечной РНК, но не с одноцепочечной РНК. ПНА, содержащие остатки Q, не проявляют термических переходов плавления, что указывает на отсутствие связывания с одноцепочечной РНК из-за стерического столкновения в Уотсон-Криковской подобной паре Q-G. По сравнению с немодифицированным ПНА P1, ПНА P4 и P5, содержащие остатки L, демонстрируют более низкую температуру плавления для соответствующих дуплексов РНК-ПНА из-за стерического столкновения в Уотсон-Криковской подобной паре L-G.

Данные о термическом плавлении, полученные методом измерения УФ-поглощения, согласуются с данными титрования флуоресценции 2-аминопурина, которые также показывают, что PNA, содержащий остатки Q и L, не обладает сильным сродством к одноцепочечной РНК. Включение основания Q приводит к большему дестабилизирующему эффекту, чем включение основания L, так как основание Q создает более значительный стерический конфликт при формировании пары Q-G по типу Уотсона-Крика. После освоения методики выполнение всех экспериментов может занять одну неделю при условии надлежащего проведения работ.

После выполнения данной процедуры можно применять другие методы, такие как зондирование и таргетирование структур РНК в клетках, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о возможности детектирования структур РНК и регуляции функций РНК с помощью двухцепочечных РНК-связывающих ПНМА. Разработка этого метода открыла исследователям в области биологии РНК и патологий путь к изучению разработки терапевтических средств, нацеленных на структуру РНК.