Последовательность конкретных и избирательное признание двуцепочечной РНК над одноцепочечной РНК, химически изменены пептид нуклеиновых кислот

Общая цель данной статьи о методах заключается в том, чтобы познакомить нас с подробными протоколами, используемыми нашей лабораторией для изучения молекулярного распознавания двухцепочечных РНК химически модифицированными пептидными нуклеиновыми кислотами. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области химической биологии РНК, такие как обнаружение и нацеливание на структуры РНК. Основное преимущество этой методики заключается в том, что принципы дизайна могут быть применимы к нацеливанию на любые дуплексные структуры РНК.

Демонстрировать процедуру будет Дезире То, научный сотрудник из моей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, добавьте четыре микролитра 35%-ного раствора глицерина к заранее подготовленным образцам РНК ПНК и аккуратно перемешайте. С помощью микропипетки и насадок для загрузки геля осторожно нанесите 20 микролитров каждого образца в заранее приготовленный полиакриламидный гель, следя за тем, чтобы в него не попадали пузырьки воздуха.

Запустите гель при постоянном напряжении 250 вольт в течение пяти часов. Через пять часов выключите электропитание и снимите стеклянную пластину с подставки для геля. Затем снимите гелевую уплотнительную ленту и разберите стеклянную пластину.

Аккуратно снимите гель со стеклянной пластины и поместите его в емкость, наполненную 350 миллилитрами деионизированной воды. Осторожно добавьте в емкость 35 микролитров бромида этидия и поставьте ее на платформу шейкера на низкой скорости на 30 минут. После утилизации раствора бромида этидии промойте гель 1,5-двумя литрами дистиллированной воды.

Затем отсканируйте гель с помощью тепловизора с зеленым лазером на 532 нанометра и эмиссионным фильтром, установленным на 610 нанометров. Количественно оценивайте интенсивность гелевых лент с помощью бесплатного программного обеспечения. Перенесите соответствующее количество двухцепочечной РНК, меченной 2-аминопурином, в чистую пробирку объемом 1,5 миллилитра.

Затем концентрируйте растворы РНК с помощью вакуумного концентратора. Далее переложите соответствующие объемы целевой ПНК для различных концентраций из заранее подготовленного основного запаса в отдельные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Концентрируйте растворы ПНК с помощью вакуумного концентратора.

Добавьте 975 микролитров инкубационного буфера в пробирку, содержащую высушенную РНК, и тщательно перемешайте, чтобы убедиться, что вся РНК растворена. После кратковременного центрифугирования раствора РНК подвергните его отжигу, поместив пробирку в предварительно нагретый тепловой блок на 10 минут. Когда закончите, выключите нагревательный блок и дайте образцу остыть до комнатной температуры.

Добавьте по 75 микролитров РНК в каждую из пробирок, содержащих высушенную ПНК, и тщательно перемешайте. Дав образцам постоять при комнатной температуре не менее одного часа, инкубируйте их при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. Теперь перенесите соответствующие количества одноцепочечной РНК, меченной 2-аминопурином, в отдельные 1,5-миллилитровые пробирки.

Перенесите соответствующие объемы целевой ПНК для различных концентраций из основного запаса в соответствующие пробирки, содержащие одноцепочечную РНК. После сушки образцов добавьте в каждую из пробирок по 75 микролитров инкубационного буфера и тщательно перемешайте. Подвергайте каждый образец отжигу, помещая каждую пробирку в предварительно нагретый нагревательный блок на 10 минут.

Дав образцам остыть до комнатной температуры, инкубируйте их при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. После этого перелейте по 70 микролитров каждого образца в квадратную кювету размером в один сантиметр. Поместите кювету во флуоресцентный спектрофотометр и измерьте излучение в диапазоне длин волн от 330 до 550 нанометров.

После завершения измерения извлеките буфер из кюветы. Промойте кювету дистиллированной водой и обсушите газообразным азотом. После повторения измерения для всех образцов построите график зависимости интенсивности флуоресценции от длины волны.

Перенесите соответствующее количество одноцепочечной РНК в отдельные пробирки объемом 1,5 миллилитра. Затем переведите соответствующие объемы целевой ПНК из основного запаса в соответствующие пробирки, содержащие одноцепочечную РНК. После сушки образцов добавьте в каждую из пробирок по 130 микролитров инкубационного буфера и тщательно перемешайте.

Подвергайте каждый образец отжигу, помещая каждую пробирку в предварительно нагретый нагревательный блок на 10 минут. Дав образцам остыть до комнатной температуры, инкубируйте их при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. Теперь перенесите 130 микролитров каждого образца в кювету из восьми микроэлементов, одна из которых содержит инкубационный буфер.

С помощью УФ-ВИД спектрофотометра измерьте поглощение каждого образца с точностью до 260 нанометров. Измеряйте при повышении температуры от 15 до 95 градусов Цельсия с последующим снижением температуры с 95 до 15 градусов Цельсия со скоростью нарастания 0,5 градуса Цельсия в минуту. Олигомеры ПНА были получены после двух очисток ВЭЖХ в обратной фазе.

Идентичность PNA может быть подтверждена с помощью анализа MALDI/TOF. Данные PAGE без денатурации позволяют предположить, что модифицированные Q и L PNA могут распознавать только двухцепочечную область РНК с парой C-G. Это специфическое и усиленное распознавание осуществляется через двойную тройную формацию T-A-U-L-G-C и Q-C-G PNA РНК.

Исследование флуоресцентного титрования с 2-аминопурином показало, что модифицированная Q и L ПНК связывается с целевой двухцепочечной РНК, но не с одноцепочечной РНК. ПНК, содержащие Q-остатки, не демонстрируют переходов термического плавления, что предполагает отсутствие связывания с одноцепочечной РНК из-за стерического столкновения в Q-G-паре Уотсона-Крика. По сравнению с немодифицированной ПНК P1, ПНК P4 и P5, содержащие остатки L, демонстрируют более низкую температуру плавления для соответствующих дуплексов РНК ПНК из-за стерического столкновения в паре L-G, подобной паре Уотсона-Крика.

Данные термического плавления, обнаруженные с помощью УФ-излучения, согласуются с данными титрования флуоресценции 2-аминопурина, которые также показывают, что ПНК, содержащая остатки Q и L, не сильно связывается с одноцепочечной РНК. Включение основания Q является более дестабилизирующим, чем основание L, поскольку основание Q имеет более значительное стерическое столкновение при формировании пары Q-G, подобной паре Q-G Ватсона-Крика. После того, как вы освоите, различные эксперименты могут быть проведены за неделю, если они будут выполнены должным образом.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как зондирование и нацеливание на структуры РНК в клетках, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, можем ли мы обнаруживать структуры РНК и регулировать функции РНК с помощью двухцепочечных РНК-связывающих ПНК. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биологии РНК и болезней к изучению структуры РНК, направленной на терапевтическую разработку.