Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Общая цель этой процедуры заключается в идентификации РНК-связывающих белков в живых клетках и картировании их РНК-связывающих областей с помощью УФ-опосредованного фотосшивания с последующей масс-спектрометрией. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эпигенетики, например, какие эпигенетические регуляторы связаны с РНК и какие белковые участки необходимы для взаимодействия. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она не предполагает очистки белковых РНК-комплексов, а потому требует мало материала и идентифицирует белки, связанные с любым типом РНК.

В представленном виде этот метод сосредоточен на ядерных белках, потому что это представляет наш научный интерес, но с незначительными изменениями на этапах фракционирования он может быть использован для изучения РНК и связывающих белков в других студенческих компартментах. После культивирования и наращивания мышиных ЭСК в соответствии с текстовым протоколом, разверните клетки до необходимого количества 10-сантиметровых пластин. Прежде чем планшеты достигнут сливаемости, добавьте четыре SU непосредственно в среду до конечной концентрации 500 микромоляров.

Оставьте контрольную посуду 4sU без обработки. Осторожно встряхните планшеты, чтобы равномерно распределить 4sU по всей среде, затем верните планшеты в тот же инкубатор для культур тканей на два часа. Эффективность инкорпорации 4sU варьируется в зависимости от типа клеток, и поэтому может потребоваться оптимизация его концентрации и времени инкубации для обеспечения эффективного сшивания и минимизации токсичности.

Далее переложите пластины в ведро со льдом и выбросьте среду. Затем используйте 5 миллилитров ледяного PBS, чтобы аккуратно промыть тарелки. Добавьте 2 миллилитра ледяного PBS и поместите пластины без крышек в сшиватель, оснащенный лампами, излучающими УФ-В.

Облучайте пластины с установкой энергии 1 Джоуль на квадратный сантиметр. Эффективная УФ-сшивка имеет решающее значение. Мы рекомендуем использовать УФ-В свет, но можно использовать и УФ-А.

В любом случае, количество используемой УФ-энергии должно быть оптимизировано и контролироваться с помощью PAR-CLIP или ChIRP. Используйте клеточные подъемники для сбора клеток и переноса их в ледяной PBS в конических трубках. Затем центрифугируйте ячейки при температуре 2000 раз g и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.

Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах ледяной PBS с 2 миллимолярными ЭДТА и 0,2 миллимолярными PMSF. С помощью гемоцитометра посчитайте клетки. Ожидайте от пяти до десяти и от десяти до двадцати миллионов ячеек из 10-сантиметровых и 15-сантиметровых пластин соответственно.

Затем центрифугируйте ячейки при температуре 2000 умножить на g и 4 градуса Цельсия в течение пяти минут. Чтобы выделить ядра из клеток, приготовьте ледяной буфер А, как указано в текстовом протоколе. Перед использованием добавьте 0,5 миллимоляра DTT и 0,2 миллимоляра PMSF к желаемому количеству буфера A. Добавьте 2 миллилитра холодного буфера в ячейки, чтобы промыть их, затем вращайте ячейки при температуре 2500 раз g и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.

Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте буфер А, дополненный 0,2 процента неионного, неденатурирующего детергента, затем поверните образец при температуре 4 градуса Цельсия в течение пяти минут. После вращения клеток в 2500 раз g в течение пяти минут удалите надосадочную жидкость. Гранула состоит из неповрежденных ядер, лишенных цитоплазмы.

Чтобы лизировать ядра, добавьте в пробирку 200 микролитров буфера для лизиса. Используйте зонд 1/8 дюйма для ультразвуковой обработки образца, чтобы сдвигать хроматин с амплитудой 50 процентов в течение пяти-десяти секунд. Вращайте образец при 12000 умноженных на g в течение пяти минут и соберите только 175 микролитров надосадочной жидкости, чтобы избежать образования гранул.

Затем измерьте концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда или аналогичного метода. Затем используйте буфер для лизиса, чтобы разбавить белок в различных образцах до 1 миллиграмма на миллилитр или самой низкой концентрации образца. Добавьте 5 миллимолярный раствор DTT в ядерный лизат и инкубируйте образец при комнатной температуре в течение одного часа.

Затем добавьте 14 миллимоляров йодоацетамида из свежего подвойя и инкубируйте лизат при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут. Разбавьте лизат в пять раз больше объема 50 миллимолярного бикарбоната аммония, затем добавьте трипсин. Инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи.

Чтобы приготовить один изготовленный по индивидуальному заказу наконечник для каждого образца, поместите диск с твердофазным материалом для экстракции C18 на дно наконечника для дозатора объемом 200 микролитров. Добавьте 50 микролитров обратно-фазированной смолы Oligo R3 поверх диска C18, затем поместите наконечник предметного столика внутрь адаптера центрифугирования и поместите адаптер внутрь пробирки для микрофуге объемом 1,5 миллилитра. Добавьте 100 микролитров 100-процентного ацетонитрила на кончики, чтобы промыть их.

Затем центрифугируйте наконечники при 1000 г в течение одной минуты, чтобы удалить растворитель. Уравновесьте наконечники 50 микролитрами 0,1 процента трифторуксусной кислоты или ТЖК. Затем снова покрутите их.

Добавьте 100-процентную муравьиную кислоту в образец переваренного белка, чтобы снизить PH до 2-3. Затем загрузите образец на специально изготовленный наконечник ступени и центрифугируйте образец при 1000 g в течение одной минуты, пока весь образец не пройдет через наконечник. Промойте связанные пептиды 50 микролитрами 0,1 процента ТФК.

Затем, после вращения образца в 1000 раз g в течение одной минуты, разбавьте пептиды, добавив 50 микролитров элюирующего буфера к ступенчатому наконечнику, и центрифугируйте при 1000 г в течение одной минуты, чтобы вытеснить элюирующий буфер из наконечника. Используйте вакуумную центрифугу, установленную на 150 м g и от 1 до 3 килпаскаль в течение одного часа, чтобы высушить образец. Чтобы удалить сшитую РНК из образца, повторно суспендируйте гранулу в 50 микролитрах 2-кратного нуклеазного буфера.

Измерьте концентрацию пептидов на глубине 280 нанометров, предполагая, что пептиды составляют 1 миллиграмм на миллилитр и A280 от 1. Используйте 2x нуклеазный буфер, чтобы довести все образцы до одного миллиграмма на миллилитр или до самой низкой концентрации, затем приготовьте мастер-смесь из 50 микролитров воды и 1 микролитра нуклеазы высокой чистоты на образец. Соедините 50 микролитров образца пептида с 50 микролитрами воды и мастер-смесью нуклеазы.

Затем инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Наконец, проведите наножидкостную хроматографию, масс-спектрометрию и обработку данных по текстовому протоколу. На этом рисунке показан вулканический график результата RBR id от ESC мыши.

Пептиды, которые перекрываются доменом мотива узнавания РНК, выделены синим цветом и демонстрируют очень стабильные уровни истощения. РНК-связывающий пептид из HNRNPC выделен красным цветом. Здесь показана тепловая карта баллов RBR id, которая рассчитывается как оценка вероятности связывания РНК белкового участка.

Оценка проецируется на поверхность сплайсосомальной субъединицы U1-70k. Ярко-красный цвет в непосредственной близости от контакта РНК, определяемый по кристаллической структуре, указывает на правильную идентификацию взаимодействия белковой РНК. На этом рисунке TET2 представлен в виде нового RBP, а активность связывания РНК картируется с С-концевой областью путем построения показателя RBR id вдоль первичной последовательности белка.

Наконец, потребность в этом новом RBR может быть проверена путем выполнения PAR-CLIP с использованием последовательности дикого типа и сравнения сигнала с сигналом мутанта, у которого отсутствует предсказанный RBR. После освоения этой техники ее можно выполнить за семь-восемь часов в течение двух дней, если она выполнена правильно. Перед сшивкой клетки могут быть стимулированы с помощью различных методов лечения, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как начинается дифференцировка или как клеточный цикл регулирует взаимодействия белков РНК.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как генерировать экстра, содержащие комплексы сшитых белковых РНК, для идентификации сайтов взаимодействия белковой РНК с помощью масс-спектрометрии.