Оснастки чип для кросс-reactivity-свободных и без корректировщик мультиплексированных Immunoassays сэндвич

Общая цель этой процедуры заключается в одновременном количественном определении нескольких белков на чипе с помощью сэндвич-иммуноанализа без использования споттера без перекрестной реактивности между реагентами. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области количественной протеомики, такие как открытие и валидация биомаркеров белков-кандидатов при раке. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он обладает перекрестной реакционной способностью между антителами и антигеном в мультиплексных сэндвич-анализах, а также в том, что пользователям не нужен сложный микрочип-споттер.

Демонстрировать процедуру будет Хайди Ларкин, научный директор Parallex BioAssays. Чтобы начать подготовку слайдов для метода одиночного переноса, закрепите новый предметный стекал на деке споттера струйных микрочипов. Используя раствор микрогранул полистирола или 30% глицерина, найдите массив выравнивающих меток на краю предметного стекла.

Используя программное обеспечение прибора и камеру корректировщика, сфотографируйте метки юстировки для контроля качества. Затем закрепите предметное стекло из нитроцеллюлозы или функционализированного стекла слева от предметного стекла на деке для корректировки струйных микроматриц. Используя метки выравнивания, определите 24 матрицы растворов антител захвата с расстоянием между центрами 400 микрометров.

Инкубируйте предметное стекло при комнатной температуре в атмосфере с относительной влажностью 60% в течение одного часа. Затем прикрепите 24-луночную силиконовую прокладку к предметному стеклу, совместимую с массивами. Пипеткой внесите 80 микролитров 0,1%-ного раствора полисорбата по 20 в PBS в каждую лунку.

Встряхните предметное стекло при 450 об/мин в течение пяти минут и выбросьте раствор. Вымойте таким образом предметное стекло три раза. Затем загрузите по 80 микролитров раствора свободной блокировки BSA в каждую промываемую лунку.

Встряхивайте предметное стекло со скоростью 450 об/мин в течение часа. Затем выбросьте раствор, снимите силиконовую прокладку и высушите предметное стекло с помощью газообразного азота или центрифуги. Запечатайте предметное стекло в герметичный пакет с силикагелем или другим влагопоглотителем и храните при температуре минус 20 градусов Цельсия.

Используя те же метки выравнивания, определите 24 массива растворов антител для обнаружения с использованием 3,2 нанолитров на пятно в интервале между центрами 400 микрометров. Храните предметное стекло при температуре минус 20 градусов Цельсия в герметичном пакете с влагопоглотителем. Чтобы начать подготовку предметных стекол для метода двойного переноса, закрепите предметное стекло на деке споттера с струйным микрочипом.

Обнаружение 24 массивов растворов антител захвата с расстоянием между центрами 400 микрометров. Затем поверните защелку аппарата плунжерных выключателей на 90 градусов, чтобы зафиксировать плунжеры в открытом положении. Установите предметное стекло для переноса захвата в аппарат так, чтобы зажатый угол был прижат к неподвижному штифту.

Освободите пого-штифты, повернув соответствующие плунжерные переключатели назад на 90 градусов. Убедитесь, что передаточный салазок надежно удерживается штифтами pogo и находится заподлицо с неподвижными юстировочными штифтами. Затем поместите новую нитроцеллюлозу или функциональное стеклянное стекло на пого-штифты стороной с покрытием вниз.

Поверните остальные три переключателя, чтобы освободить прямые контакты. Убедитесь, что оба ползуна удерживаются на месте относительно неподвижных выравнивающих контактов. Затем установите верхнюю оболочку на держатель слайда так, чтобы стойка была установлена в юстировочных отверстиях.

Вставьте закрытый аппарат в защелкивающийся каркас и полностью нажмите на защелку. Оставьте аппарат закрытым на одну минуту. Затем потяните вверх защелку, чтобы освободить аппарат от клетки.

Снимите верхнюю оболочку и отделите пробирное и трансферное стекла. Инкубируйте предметное стекло в течение часа. Затем прикрепите 24-луночную силиконовую прокладку к предметному стеклу и промойте предметное стекло три раза.

Затем встряхните предметное стекло с помощью блокирующего раствора без BSA в течение часа. Снимите прокладку и высушите предметное стекло под струей газообразного азота или центрифугой. Далее закрепите еще один переводной слайд на деке струйного споттера.

Разместите на предметном стекле 24 массива растворов антител для обнаружения с концентрацией 3,2 нанолитра на пятно с расстоянием между центрами 400 микрометров, чтобы получить предметное стекло. Храните предметное стекло при температуре минус 20 градусов Цельсия. Для начала иммуноанализа достаньте подготовленное предметное стекло из морозилки и дайте ему нагреться до комнатной температуры в герметичном пакете в течение 30 минут.

Приготовьте семь последовательно разведенных растворов белков в PBS с 0,05%полисорбатом 20. В том же буфере приготовьте соответствующим образом разбавленные растворы образцов. Зажмите 24-луночную силиконовую прокладку на предметном стекле для анализа при комнатной температуре.

Загрузите семь разведений белка в семь из восьми лунок в колонне. Загрузите безбелковый PBS с 0,05% полисорбата 20 в последнюю лунку этой колонки. Загрузите образцы растворов в оставшиеся лунки.

Встряхивайте предметные стекла при 450 об/мин в течение одного часа при комнатной температуре или при 4 градусах Цельсия в течение ночи. Затем вымойте горку три раза. Снимите прокладку и просушите предметное стекло под струей газообразного азота.

Затем дайте обнаруженному антителу перенести предметное стекло в теплое состояние до комнатной температуры на 30 минут в герметичный пакет. Затем инкубируйте предметные стекла в течение 20 минут в закрытой камере с относительной влажностью 60% для регидратации массивов. Используйте пого-штифты, чтобы зафиксировать предметное стекло передачи обнаружения лицевой стороной вверх в устройстве защелки.

Поместите предметное стекло лицевой стороной вниз на булавки и совместите предметное стекло с прямыми булавками. Закройте аппарат и с щелчком перенесите антитела обнаружения на предметное стекло. Снимите предметные стекла с аппарата и инкубируйте предметное стекло в течение одного часа.

Прижмите к предметному стеклу силиконовую прокладку на 24 лунки и промойте предметное стекло три раза. Затем загрузите в каждую лунку по 80 микролитров 2,5 микрограмма на миллилитр раствора стрептавидина фтор-4 в PBS. Встряхивайте предметное стекло при 450 об/мин в течение 20 минут.

Промойте предметное стекло три раза 0,1%-ным раствором полисорбата 20 в PBS и один раз дистиллированной водой. Затем снимите прокладку и просушите горку. Отсканируйте предметное стекло с помощью флуоресцентного сканера и измерьте интенсивность пятна.

Определите пределы обнаружения в концентрациях белка. Два флуоресцентных белка были последовательно структурированы на предметном стекле, покрытом нитроцеллюлозой, с использованием метода двойного переноса с 16-луночным шаблоном. При переносе второго флуоресцентного белка перекрестной контаминации не наблюдалось.

Более мелкие пятна с уменьшенным расстоянием от пятна до пятна могут быть перенесены на предметное стекло с сильно гидрофобной поверхностью. Метод двойного переноса привел к минимальному угловому смещению массивов. Метод двойного переноса был использован для проведения 50-плексного иммуноферментного анализа белков, связанных с раком молочной железы, в формате сэндвич-анализа.

Перекрестной реактивности не наблюдалось, что позволило провести независимую оптимизацию каждой пары антител. Стандартные кривые, рассчитанные на основе анализов, показали, что 35 из 50 белков имели пределы обнаружения пикограмма на миллилитр. После освоения этой техники она может быть выполнена примерно за три часа.

Этот метод позволяет ученым проводить анализ на основе микрочипов и доставлять реагенты в виде нанокапель. Пытаясь выполнить эту процедуру, не забудьте правильно закрепить слайды на споттинг-деке и в защелке. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как использовать аппарат snap для мультиплексного сэндвич-иммуноанализа без перекрестной реактивности.