RGB и спектральные корень изображений для растений фенотипа и физиологических исследований: экспериментальная установка и визуализации протоколы

Общая цель этой процедуры заключается в получении исчерпывающей информации о корнях растений, растущих в заполненных почвой ризобоксах, путем комбинации различных методов визуализации. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области фенотипии и селекции растений, такие как вклад различных архитектур корней в повышение устойчивости к абиотическому стрессу. Основное преимущество этого подхода заключается в том, что он сочетает в себе RGB-визуализацию для корневой архитектуры и гиперспектральную визуализацию для корневой функциональности.

Потенциал использования гиперспектральной визуализации корней распространяется на широкий диапазон параметров ризосферы, поскольку спектральная информация может выявить мелкомасштабные физико-химические изменения, внесенные корнями растений. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы наполнения ризобокса должны выполняться осторожно. В противном случае это негативно скажется на росте корней и видимости корней.

Начните эту процедуру с подготовки ризобоксов к заполнению субстрата, как подробно описано в текстовом протоколе. Предварительно смочите сухую почву до гравиметрического содержания воды 0,108 грамма на грамм, добавив 400 грамм воды на 3,705 грамма сухой почвы. Осторожно перемешайте почву и воду, чтобы получить равномерное распределение воды.

Вручную разрушайте более крупные агрегаты, чтобы размер частиц был меньше или равен двум миллиметрам. Очень важно получить однородный слой почвы рядом с окном газового наблюдения, не допуская воздушных зазоров. Кончики корней растений быстро обезвоживаются, разрастаясь в воздушные промежутки.

Кроме того, это отрицательно сказывается на качестве спектрального изображения для картографирования водных ресурсов. Засыпьте предварительно увлажненную почву в открытые ризобоксы и аккуратно уплотните ее с помощью листа полистирола, чтобы покрыть внутренний объем коробки, тем самым получив однородную насыпную плотность 1,3 грамма на кубический сантиметр. Добавьте оставшееся количество воды, чтобы достичь целевого содержания воды в 0,31 кубических сантиметра на кубический сантиметр, распыляя на поверхность из пульверизатора.

Обеспечьте небольшой размер капель, чтобы избежать деградации структуры поверхности, а также однородного смачивания. Держите бокс на балансе во время распыления, чтобы следить за количеством воды, фактически добавленной в субстрат. Дайте воде перераспределиться в течение 10 минут, а затем прижмите стекло к поверхности и зафиксируйте его боковыми металлическими рейками.

Средний итоговый вес ризобоксов с увлажненным субстратом составил 17 818 плюс-минус 68 грамм. Оборудуйте климатическую комнату восемью светодиодными лампами, обеспечивающими равномерное освещение 450 микромоль на квадратный метр в секунду со спектральными пиками на 440 и 660 нанометров для оптимального роста растений. После установки параметров окружающей среды в соответствии с растением и потребностями эксперимента закройте стеклянное окно деревянной пластиной, чтобы сохранить корневую зону в темноте и избежать роста водорослей из-за света, проникающего через стеклянную поверхность.

Затем поставьте ризобоксы под углом 45 градусов, используя соответствующий металлический каркас. Это максимизирует рост корней по направлению к поверхности стекла благодаря гравитропизму. Для визуализации корня RGB подсвечивайте ризобокс с помощью четырех 24-ваттных люминесцентных ламп, прикрепленных на расстоянии 80 сантиметров от ризобокса.

Также установите четыре 15-ваттные УФ-трубки на расстоянии 20 сантиметров от альтернативного освещения ризобокса, используя автофлуоресценцию корня в случае низкого контраста между корнем и ярко окрашенным фоном субстрата. Включите ультрафиолетовые лампы, а затем установите ризобокс для визуализации в держатель коробки для визуализации. Далее сделайте два снимка, чтобы покрыть верхнюю и нижнюю половину ризобокса с перекрытием около трех сантиметров.

Получение и обработка изображений RBG в соответствии с текстовым протоколом. Наконец, запустите анализ полученных корневых изображений RBG и затем проконтролируйте, есть ли области, которые не совпадают. В этом случае определите регион исключения и перезапустите анализ.

Для неклассифицированных корней добавьте дополнительные классы цветов и перезапустите анализ. Для элементов, ошибочно классифицированных как корни, активируйте или увеличьте параметры фильтрации мусора и шероховатых краев. Выполните получение изображения, сначала определив время интеграции камеры для сканирования ризобокса и стандарт белого в программном обеспечении камеры.

Для этого откройте графический интерфейс визуализации и переместите камеру в положение ризобокса, где присутствуют корни. Отрегулируйте время интеграции камеры, нацеленной на световой объект, таким образом, чтобы на гистограмме, отображаемой программным обеспечением, использовалось примерно 85% полного динамического диапазона камеры. Правильная настройка времени интеграции для различных субстратов и тканей корня имеет решающее значение для полного использования динамического диапазона инфракрасной камеры, избегая потери информации из-за превышения ее диапазона.

Повторите процесс для стандарта белого, переместив систему позиционирования камеры в положение стандарта белого перед закрытием программного обеспечения камеры. Затем откройте графический интерфейс Matlab и введите все настройки из текущего сканирования ризобокса. Получайте темные и белые стандарты перед каждым сеансом съемки один раз в день.

Темный стандарт представляет собой шум камеры, в то время как белый стандарт дает максимальную отражательную способность. Эти данные необходимы для нормализации изображения во время предварительной обработки. Укажите, сканируется ли ризобокс целиком или только его часть.

В данном случае изображены целые ризобоксы. Затем запустите сканирование. Для спектрального измерения содержания воды необходим калибровочный ризобокс.

Разделите ризобокс на пятисантиметровые отсеки с помощью листов полистирола, чтобы заполнить их грунтом с разным содержанием воды. Отсканируйте калибровочный ризобокс с теми же настройками, что и для посаженных ризобоксов. В качестве примера, чтобы объединить корневые и надземные признаки, приобретите листовой порометр для измерения проводимости устьиц.

Выровняйте устройство в соответствии с условиями окружающей среды в течение не менее одного часа в климатической камере. Измеряйте не менее трех листьев на растении. Здесь показано репрезентативное изображение роста корней сорта сахарной свеклы Ferrara, основанное на RGB-изображениях.

На 35 день после посева корни растения удлиняются, чтобы достичь дна корневища. Некоторые корневые оси в верхней части ризобокса не могли быть сегментированы по изображениям RGB. Старение старых прикорневых корней меняет их цвет на коричневый.

Поэтому разделение между этими корнями и почвенным фоном на основе цветового порога не удается. При использовании гиперспектральной визуализации сегментация основана на различных спектральных особенностях переднего плана корня и фона почвы. Это улучшает результат сегментации.

Разница в измеренной длине корня по сравнению с эталонным изображением, отслеживаемым вручную, составляет всего 1,5%Кроме того, спектральная визуализация позволяет точно картировать содержание воды вокруг корня, чтобы сделать вывод о поглощении воды. Вот скелет корня показан черным цветом. Более светлые области показывают области с более высоким истощением воды вблизи корневых осей.

В то время как темно-синие области представляют собой регионы с более высоким содержанием воды в почве вне досягаемости корней. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как правильно заполнять ризобоксы, чтобы обеспечить удовлетворительный рост корней и видимость. Это является основой для более поздних результатов визуализации и репрезентативного фенотипирования корней.

Следуя этой процедуре, можно использовать другие методы спектральной классификации, такие как кластеризация K-средних или метод опорных векторов, для получения подробной информации о свойствах корня и ризосферы, таких как старение и разложение корня. Как только этот метод будет установлен, он позволит вам всесторонне фенотипировать корневые системы и абиотическую реакцию на стресс. Набор из 10 сортов может быть охарактеризован общей продолжительностью эксперимента менее трех месяцев.