Количественная оценка информации, кодируемых ген выражение уровня во время жизни модуляции под широкий диапазон диетическое ограничение в C. elegans

Общая цель этой структуры состоит в том, чтобы идентифицировать гены, участвующие в широком диапазоне диетических ограничений, количественно оценить информацию об окружающей среде, закодированную уровнями их экспрессии, и понять лежащую в основе стратегию кодирования, которая связывает окружающую среду с продолжительностью жизни. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии старения, например, какие гены передают информацию из окружающей среды для модуляции продолжительности жизни. Несмотря на то, что эта структура может дать представление о сенсорной системе C Elegan, она также может быть применена в более общем плане к любой биологической системе, компоненты которой взаимодействуют друг с другом для обработки информации об окружающей среде.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он количественно оценивает информацию об окружающей среде, закодированную группами нейронов, и определяет стратегию кодирования, используемую нейроселкитами для передачи этой информации нижестоящим целям. После культивирования OP50 на пластинах MGM в соответствии с текстовым протоколом приготовьте по 500 миллилитров среды LB в каждой из двух литровых колб Эрленмейера и автоклавируйте их. Инокулируйте каждую колбу одной колонией OP50 и выращивайте культуры при температуре 37 градусов Цельсия и 200 оборотах в минуту в течение примерно 14 часов.

Далее дополните культуры 50 микрограмм на миллилитр стрептомицина. Затем встряхните колбы еще 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия, прежде чем поместить колбы на лед на 15 минут. Перелейте по 450 миллилитров каждой культуры в отдельные 500 миллилитровые стерильные центрифуговые флаконы, остатки культуры сохраните на льду, так как она будет использоваться для определения концентрации бактерий.

Уменьшите температуру бутылок при температуре 4500 x G и четырех градусах Цельсия в течение 25 минут, затем выбросьте надосадочную жидкость и храните бутылки на льду. С 900 микролитрами стерильного LB разведите по 100 микролитров остатков культуры из каждой колбы. Используйте один миллилитр стерильного LB для обнуления спектрофотометра, а затем определите OD600 при 10-кратном разведении каждой культуры.

Если, например, OD600 при 10-кратном разведении культуры за ночь равен 0,28, то фактический OD600 культуры равен 2,8. Из этого примера, чтобы получить раствор рабочего состава в соотношении 1,12 х 10 до 10-го OP50 клеток на миллилитр, что равно OD600 из 56, повторно суспендируют гранулу из культуры объемом 450 мл в одной 20-й от первоначального объема или 22,5 миллилитров стерильного базального раствора S или SB, дополненного 50 мкг на миллилитр стрептомицина. Все последующие концентрации, используемые в экспериментах по СБ и стрептококку, производят из серийных разведений рабочего состава, используя коэффициенты разведения, перечисленные в данной таблице.

После культивирования и синхронизации репортерных штаммов C Elegans в соответствии с текстовым протоколом используйте 15 миллилитров SB для последовательного смывания червей с трех планшетов и соберите жидкость в стерильную 15-миллилитровую пробирку. Дайте личинкам L4 естественным образом отложиться, а затем отасуньте все, кроме примерно 0,5 миллилитров жидкости. В репортерных линиях дикого типа, этот тип удаляет все личинки моложе L4.In мутантного фона, этот шаг помогает в удалении любых арестованных личинок, таких как наша, в случае смерти OK3125.

Затем используйте девять миллилитров SB для повторного суспендирования червей. Опять же, контролируйте скорость осаждения личинок L4, а затем аспирируйте все, кроме примерно 0,5 миллилитров надосадочной жидкости, как только большая часть личинок L4 будет гранулирована, прежде чем повторять процесс. Добавьте 10 микролитров стерильной базальной среды S, дополненной 0,1%плуроновой F127, в жидкость, содержащую личинки L4.

Это действует как поверхностно-активное вещество и предотвращает прилипание личинок к внутренней поверхности пластиковых наконечников пипеток. С помощью наконечника пипетки P200 с низким удержанием аккуратно повторно суспендируйте личинки, а затем нанесите 150 микролитров на три 10-сантиметровые пластины РНК-интерференции, которые засеяны 5 x 225 микролитрами яичных пяти РНК-интерференциальных бактерий. Убедитесь, что черви равномерно распределены по всем пяти бактериальным газонам.

После того, как жидкость впитается в агар, удалите с пластин все личинки, не относящиеся к L4, которые не были устранены процедурой промывки, вручную сняв их. Затем храните пластины при температуре 20 градусов Цельсия в течение 24 часов. Чтобы начать широкий спектр DR, удалите всех молодых личинок, которые избежали предыдущего этапа ручного удаления, оставив на пластинах только однодневных взрослых особей.

Для каждого штамма используйте 15 миллилитров стерильного стрептококка SB, чтобы промыть однодневных взрослых особей из трех тарелок в 15-миллилитровую трубку. Дайте червям естественным образом осадиться, а затем всосайте все, кроме 0,5 миллилитров надосадочной жидкости. Повторно суспендируйте червей с 9,5 миллилитрами стрептококка SB и повторите этапы отстаивания и промывания.

После окончательной промывки и аспирации всех надосадочных веществ, кроме 0,5 миллилитров, добавьте 10 микролитров SB Plu и с помощью наконечника пипетки P200 аккуратно повторно суспендируйте личинки. Внесите 100 микролитров личинок на планшет NSC, засеянный 5 x 225 микролитрами бактерий, в концентрации от 2 x 10 до девяти клеток на миллилитр. Равномерно распределите 100 микролитров по всем пяти газонам с бактериями.

Под микроскопом оцените количество животных, присутствующих на пластине, стремясь к тому, чтобы на каждой пластине было от 100 до 150 червей. Определите объем жидкости, необходимый для достижения плотности червяка в этом диапазоне, а затем распределите его на двух дополнительных пластинах. Отрегулируйте количество червей на первой пластине, чтобы они также попадали в этот диапазон.

А затем храните пластины при температуре 20 градусов Цельсия в течение 24 часов. На следующий день соберите двухдневных взрослых особей и распределите червей по новым тарелкам НСК, засеянным желанием экспериментальной концентрации пищи. Как только жидкость впитается в агар, переместите пластины на нужную экспериментальную температуру на 24 часа.

На следующий день соберите трехдневных взрослых особей и распределите их по свежим тарелкам NSC, засеянным той же экспериментальной концентрацией пищи. Как только жидкость впитается в агар, верните пластины к экспериментальной температуре на 48 часов. Наконец, используйте микрофлюидное устройство для визуализации животных перед сборкой и количественной оценкой данных в соответствии с текстовым протоколом.

Как показано на рисунке, средняя продолжительность жизни дикого штамма n2 типа демонстрирует комплексную реакцию на широкий спектр DR. Величина этой реакции ослаблена у полностью мутантного гена daf-7, что позволяет предположить, что этот ген влияет на способность червя правильно реагировать на изменения в изобилии пищи. Средние уровни экспрессии транскрипционного репортера для гена daf-7 и дикого типа также демонстрируют сложную немонотонную реакцию на широкий спектр DR.In daf-7 (генетический фон, экспрессия этого транскрипционного репортера сильно ослаблена и показывает слабую реакцию на изменения уровня пищи. На этом рисунке показана оценка совместного распределения экспрессии TPH1 в нейронах ADF и экспрессии daf-7 в нейронах ASI для данного уровня пищи.

Эти гистограммы представляют информацию о пище, закодированную, комбинаторно или по отдельности, нейронами ADF, ASI и NSM, на основе уровней экспрессии генов TPH1 и daf-7. Избыточные и синергетические признаки кодирования являются результатом сравнения комбинаторной и индивидуальной информации, кодируемой нейронами, представленной разницей в высоте сложенных столбцов справа и информации, закодированной полной цепью. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что репликация теории информации для количественной оценки стратегии кодирования требует точной оценки распределений экспрессии генов.

По этой причине размер выборки является критическим фактором для общей применимости данной системы. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как проводить обширные эксперименты по ограничению питания, чтобы выявить и охарактеризовать новые гены, которые связывают изобилие пищи с продолжительностью жизни.