Твердые пластины основе Диетические ограничения в Caenorhabditis Элеганс

Процедура выполняет диетическое ограничение на стандартной тарелке на основе морской элегантности для изучения ее влияния на долголетие, репродуктивную функцию и обмен веществ. Это достигается путем точного измерения концентрации бактерий, которые будут использоваться в качестве источника пищи. Вторым этапом процедуры является правильное разбавление бактериальной культуры до подходящих концентраций.

Затем приготовьте на основе SDR пластины с убитыми бактериями. Наконец-то наладили эксперименты по SDR с синхронизированной по возрасту популяцией червей. Результаты измерений производства потомства и продолжительности жизни могут показать задержку и снижение производства потомства, а также увеличение средней продолжительности жизни.

Основное преимущество этой методики по сравнению с 60 методами, подобными Dian в среде AZA, заключается в том, что весь эксперимент будет проводиться на стандартной твердой игре на основе AGA, которая используется большинством теплых лабораторий. Выберите одну колонию бактерий кишечной палочки OP 50 из свежей полосы на фунте агара и введите три миллилитра культуры жидкого бульона в шейкер при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. Готовят серийное двукратное разведение культуры на ночь.

Затем измерьте поглощение каждого разведения на 600 нанометрах с помощью спектрофотометра в трех экземплярах. Далее измельчите каждую бактериальную суспензию, равномерно посейте 0,4 миллилитра бактериальной суспензии каждого разведения на 100-миллиметровую фунтовую сельскохозяйственную тарелку и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 18-24 часов. Подсчитайте количество колоний бактерий, выращенных на каждой пластине, чтобы рассчитать колониеобразующие единицы на миллилитр для каждого образца.

Теперь построите график OD 600 как функцию концентрации бактерий и выполните линейный регрессионный анализ, чтобы установить связь между измеренными значениями OD 600 и концентрациями бактерий OP 50. Для этого метода используется концентрация бактерий от 10 до 11-го КОЕ на миллилитр в условиях кормления ad lido и от 10 до 10 до восьмой КОЕ на миллилитр в качестве оптимального условия кормления DR. Тем не менее, для установления полной зависимости от дозы может потребоваться от четырех до шести различных концентраций бактерий.

Для SDR и их ответов. Приготовьте инокулюм с одной колонией бактерий кишечной палочки OP 50 в трех миллилитрах жидкого бульона LB, культивируемом в шейкере при температуре 37 градусов Цельсия в течение шести-восьми часов. Переложите культуру OP 50 в новую колбу, содержащую 500 миллилитров бульона LB, и выращивайте в течение ночи, чтобы бактерии при необходимости достигли насыщения.

Приготовьте соответствующее разведение культуры OP 50 для измерения абсорбции при наружном диаметре 600. Чтобы определить концентрацию бактерий, гранулируйте бактерии центрифугированием при давлении 1500 G в течение 20 минут. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте бактерии до концентрации один умно-10 при 12-м КОЕ на миллилитр.

Теперь приготовьте 10 миллилитровых бактериальных культур в шести различных концентрациях, в диапазоне от одного умножить на 10 из 12-й до 10 раз по 10 седьмых КОЕ на миллилитровую пипетку. Поместите два миллилитра бактериальной культуры в центр 60-миллиметровой затвердевшей пластины N GM. Избегайте прикосновения кончиком пипетки к поверхности пластины, так как зазубрины на поверхности позволяют червям проникать в аэраты.

Поместите пластины в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на один час. Затем нанесите 10 микролитров 100 миллиграммов на миллилитр карбоина и 10 микролитров 50 миллиграммов на миллилитр мицина на каждую пластину, чтобы успокоить рост бактерий. Храните планшеты с различными концентрациями убитых антибиотиками бактерий при температуре четыре градуса Цельсия для дальнейшего использования до одного месяца.

Важно подготовить и хранить достаточное количество тарелок, желательно одной и той же партии на весь завод. Экспериментируйте по крайней мере за один-два дня, чтобы проверить жизнеспособность бактерий. Соскребите немного бактерий с планшетов SDR и распределите их на пустой пластине N GM с углекислым газом, сеином и антимицином.

Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на шесть-восемь часов и убедитесь в отсутствии роста бактерий. Для большинства исследований, связанных с SDR, таких как анализ продолжительности жизни и профилирование производства потомства, подготовка синхронизированной по возрасту популяции червей имеет важное значение. Используйте автомат для сбора платиновых червей, чтобы перенести от 20 до 30 репродуктивно активных взрослых особей на несколько обычных пластин для НГМ.

С ОП 50. В зависимости от количества яиц, необходимых для экспериментов, может потребоваться больше взрослых особей. Оставьте тарелки при температуре 20 градусов Цельсия на четыре часа, чтобы дать возможность отложить яйца.

Снимите взрослых особей с тарелки и визуально осмотрите тарелки на наличие яиц. Продолжайте инкубировать планшеты при температуре 20 градусов Цельсия, чтобы позволить потомству развиться до поздней стадии L четыре дня и одного взрослого человека. Обычно для этого требуется три дня для N двух червей дикого типа при температуре 20 градусов Цельсия.

Для анализа продолжительности жизни. Перенесите 10-12-дневных взрослых червей на планшет SDR, чтобы начать ограничение рациона. Чтобы получить достаточную статистическую мощность, используйте в общей сложности от 60 до 100 червей для каждого условия SDR.

Оценивайте жизнеспособность каждого червя каждые два-три дня, пока все черви не умрут. Важно переводить червей на свежие планшеты SDR через день, чтобы избежать голодания. Эта калибровочная кривая отображает концентрацию OP 50 по отношению к наружному диаметру 600.

Уравнение, полученное в результате линейного регрессионного анализа, может быть использовано для всех будущих расчетов концентраций бактерий OP 50. В этом исследовании анализируется влияние хронического лечения SDR на среднюю продолжительность жизни различных штаммов червей по сравнению с нормальной дозозависимой реакцией червей дикого типа на SDR. Эффект продолжительности жизни SDR частично подавляется сверхэкспрессией DR two, в то время как мутация DAF 16 MU 86 не влияет на индуцированное SDR увеличение продолжительности жизни.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как исполнять Диан в стандартной игре на основе AGA в морской элегантности.