Иммуноокрашивания для модификации ДНК: Вычислительный анализ конфокальный изображений

Недавно обнаружил окисленные формы 5-метилцитозин (oxi-mCs), 5-Гидроксиметилцитозин (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) и 5-carboxylcytosine (5caC) может представлять различные модификации ДНК с уникальными функциональными ролями. Здесь описан полуколичественного рабочего процесса для визуализации пространственного распределения oxi-mCs, профилирование интенсивности сигнала и colocalization.

Общая цель этого метода состоит в том, чтобы предоставить вычислительный инструмент для оценки пространственного распределения и интенсивности сигналов модификаций ДНК, визуализируемых с помощью иммуноокрашивания в ядрах. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эпигенетики, позволяя исследовать ядерную локализацию и относительные уровни модификаций ДНК в различных модельных системах. Основное преимущество этой методики заключается в том, что модификации ДНК измеряются по величине сигнала бота, а затем по его распределению.

Одним из следствий этого метода является то, что он облегчает понимание потенциальных функциональных рядов модификаций ДНК в различных биологических системах. Этот метод также имеет дополнительное применение вычислительного анализа других эпитопов, обнаруживаемых с помощью иммуногистохимии. Для начала откройте файлы изображения конфокальной микроскопии в формате LSM.

Выберите обработку изображения, а затем выберите нужное изображение для анализа. Обратите внимание, что при сравнении профилей интенсивности между образцами мощность и усиление лазера должны быть постоянными, чтобы можно было проводить прямые сравнения. Затем нажмите «Показать все», чтобы сделать видимыми все графические элементы управления, затем выберите вкладку «Графика» и выберите инструмент «Прямоугольник», чтобы выбрать область, содержащую интересующие ядра.

Затем используйте команду cut region для изоляции интересующей области. Теперь сохраните изображение под новым именем и в формате LSM или CZI и снова откройте файл в программе Zen Blue. Откройте стол ZEN в Zen Blue, затем используйте команду «Отправить в ZEN» в Zen Black, чтобы открыть файл в Zen Blue.

Далее активируйте вкладку с надписью 2.5d, чтобы включить визуализацию изображения в 2.5d. Нажмите «Показать все», чтобы сделать видимыми все графические элементы управления и изменить настройки с помощью четырех серых полос. Полосы управляют масштабированием, вращением, наклоном оси, а также расширением и сжатием масштабных линеек.

Выберите режим рендеринга, чтобы наилучшим образом визуализировать отдельные пики, а затем измените большое расстояние, изменив процентное соотношение. Чем меньше процент, тем более определен каждый отдельный пик. Теперь перед сохранением изображения 2.5d скройте список файлов и графические инструменты, нажав на серую стрелку под графиком 2.5d.

Затем сохраните сюжет в виде скриншота с помощью клавиши print screen на клавиатуре. Откройте опцию обработки изображений в программном обеспечении и откройте интересующий файл. Затем выберите вкладку профиля и выберите вкладку «Показать все», чтобы получить доступ ко всем параметрам форматирования.

На вкладке профиля выберите вариант стола и кнопку со стрелкой. Теперь с помощью мыши выберите начальную точку и проведите линию по непрерывному числу ячеек, график интенсивности для ячеек вдоль этой линии, затем генерируется вместе с таблицей измерений интенсивности. Обратите внимание, что в таблице также указано расстояние, на котором интенсивность пикселей является красной для красной, зеленой и синей флуоресценции.

Единица измерения – микроны. Чтобы экспортировать эти данные, щелкните правой кнопкой мыши по таблице, выберите «Сохранить таблицу» и сохраните ее в виде текстового файла. Чтобы сохранить профиль интенсивности, выберите опцию экспорта, во всплывающем окне переключите две опции: файл изображения с тегами, формат и содержимое окна изображения, одна панель, данные.

Затем следуйте инструкциям для сохранения файла. Теперь повторите этот процесс для каждого необходимого профиля интенсивности. В программном обеспечении выберите обработку изображений и выберите интересующий вас файл изображения.

Затем выберите вкладку с надписью coloc для анализа совместной локализации и нажмите кнопку Показать все, чтобы получить доступ ко всем параметрам форматирования. На четырех вкладках в нижней половине экрана выберите колокализацию и выберите параметры таблицы и изображения. Затем выберите третий значок в верхней части вкладки, идентифицируемый всплывающим текстом, закрытым бесье.

Используйте этот инструмент, чтобы окружить одно ядро. После этого значения появятся в таблице, и будет построена точечная диаграмма для красной и зеленой флуоресценции. Ось этого графика подвижна, и это контролирует стробирование обнаружения.

Все интенсивности пикселей внутри ядра следует рассматривать как положительные сигналы. Поскольку уровни модификаций ДНК варьируются в разных частях ядра, чтобы учесть слабые сигналы, мы не проверяем данные. Здесь следует подчеркнуть, что вопрос о том, следует ли включать в анализ фоновые значения, является спорным.

Важно отметить, что коэффициент перекрытия не зависит от разницы в интенсивности сигнала между двумя каналами. В то время как коэффициент корреляции человека предполагает линейную зависимость между сигналами. Теперь повторите этот процесс окружения ядер, чтобы завершить набор данных.

Затем, чтобы экспортировать данные, щелкните правой кнопкой мыши по таблице и следуйте инструкциям по сохранению данных. Чтобы сохранить изображение для совместной локализации, используйте команду экспорта с двумя вариантами: файл изображения с тегами, формат и содержимое окна изображения на одной панели, данные, затем следуйте параметрам для сохранения файла. Пространственное распределение двух окисленных дериратов пяти метилцитозина изучали при дифференцировке хафадических предшественников с использованием описанного протокола.

Красный и зеленый сигналы представляют собой две различные модификации ДНК. Сигналы хорошо выражены с ограниченным перекрытием. В соответствии с ожиданиями, профили двух интенсивностей сигнала и соответствующей ячейки сильно не совпадают друг с другом.

Отчетливая картина позволяет предположить, что зависимое от ответвления окисление пяти метилцитозина может генерировать различные окисленные производные в определенных областях хроматина. Аналогичное сравнение двух модификаций ДНК было проведено в клетках медуллобластомы Daoy и в клетках эпендимомы BXD. Обе клеточные линии происходят от опухолей головного мозга у детей.

Количественное определение показало, что клетки BXD демонстрируют значительно более низкие уровни обоих сигналов по сравнению с клетками Daoy. Следующая колокализация окисленных производных 5МК была исследована в недифференцированных ИПССК. Через 24 часа после индукции печеночной эндодермы дифференцировки и ИПСК

В этом анализе колокализация сигнала значительно изменилась с индукцией дифференцировки, что, возможно, связано со снижением величины CAC на пять в недифференцированных клетках. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как создавать графики и профили интенсивности 2,5D, а также как получать данные совместной локализации. Описанные здесь инструменты анализа и визуализации изображений вносят свой вклад в эпигенетические исследования, обеспечивая относительно быстрый способ сравнения сигналов различных модификаций ДНК в разных экспериментальных группах.

После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за час, если она выполнена правильно. Важно избегать передержки и использовать одни и те же настройки для разных экспериментальных групп во время микроскопии. Пузырьки воздуха в креплении и недостаточное погружение могут стать причиной локальной потери флуоресценции, поэтому визуальный осмотр области сканирования имеет решающее значение.

Процедура может быть дополнительно автоматизирована путем сегментации ядер и создания областей интереса с помощью Zen Blue. Эти области могут быть импортированы в Zen Black для выполнения анализа колокализации на нескольких ядрах.