Моделирования Зика вирус развивающегося мозга человека в пробирке с помощью стволовых клеток получены мозгового Organoids

Общая цель этой процедуры заключается в моделировании инфекции, вызванной вирусом Зика, в развивающемся мозге человека с использованием церебральных органоидов, полученных из стволовых клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии, такие как какие клетки способны быть инфицированы и какие белки участвуют в пути заражения. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он имитирует раннюю инфекцию человека, может использоваться в высокопроизводительных анализах и может сочетаться с фокусными генетическими методами, такими как CRISPR.

Этот метод может дать представление о механизме заражения вирусом Зика. Он также может быть применен к другим системам, таким как скрининг лекарств и псевдотипирование вирусов. Используя обычные методы поддержания стволовых клеток, доведите конфлюенцию культур до 50-70%.

Осмотрите культуры с помощью светлопольной микроскопии с увеличением от 10 до 20 раз и убедитесь, что колония имеет здоровую морфологию без обнаруживаемой дифференцировки. Доведите среду для поддержания стволовых клеток, свободных от ксино, до 37 градусов Цельсия в горячей водяной бане и разморозьте два миллилитра реагента для ферментативной отслойки и 50-литровый флакон стокового ингибитора горных пород при комнатной температуре. Затем подготовьте сверхнизкую насадку U дна 96 луночной пластины, многоканальную пипетку p200 и резервуар для реагентов объемом 25 миллилитров.

Далее аликвотируем 45 миллилитров среды в 50 миллилитровую коническую трубку. Добавьте 45 микролитров ингибитора горных пород и тщательно перемешайте ингибитор, перетирая смесь, а затем от двух до четырех в версиях. Вакуумируйте две лунки из шести лунок, содержащих стволовые клетки, и быстро добавьте по одному миллилитру реагента для отделения без фермента в каждую лунку, затем инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех минут.

Далее вакуумную аспирацию обработанных лунок и добавление в каждую лунку по одному миллилитру реактива для ферментативной отслойки. После пятиминутной инкубации при температуре 37 градусов Цельсия извлеките планшет из инкубатора. Аккуратно постучите по пластине, чтобы разбить все агрегированные ячейки.

Далее осмотрите клетки под микроскопом. Если крупные клеточные кластеры все еще видны, инкубируйте планшет в течение двух дополнительных минут при температуре 37 градусов Цельсия. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока кластеры не перестанут быть видны невооруженным глазом.

После того, как клетки будут правильно диссоциированы, добавьте по одному миллилитру среды для поддержания свободных ксеносвободных стволовых клеток в каждую лунку, чтобы деактивировать ферменты диссоциации. Втяните клеточную суспензию в коническую трубку объемом 50 миллилитров и возьмите небольшую аликвоту для подсчета клеток. Во время центрифугирования подсчитайте клетки и определите объем повторной суспензии, необходимый для достижения 60 000 клеток на миллилитр суспензии.

Осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в концентрации 60 000 клеток на миллилитр в среде, содержащей ингибитор горных пород. Используя пятимиллилитровую пипетку, осторожно перемешайте клетки от пяти до 10 раз, чтобы обеспечить равномерную суспензию клеток. Немедленно добавьте клеточную суспензию в резервуар для реагента и с помощью многоканальной пипетки p200 переведите 150 микролитров в каждую лунку сверхнизкой насадки на нижнюю 96-луночную пластину.

Затем центрифугируйте планшет при температуре 150 x G в течение одной минуты, а затем поместите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия. Не тревожьте тарелку в течение 48 часов. Начиная со второго дня, приготовьте 17 миллилитров среды, содержащей 17 микролитров стокового ингибитора горных пород, в конической пробирке объемом 50 миллилитров.

Прогрейте смесь до 37 градусов Цельсия на водяной бане. Возьмите органоидную пластину из инкубатора и с помощью многоканальной пипетки p200 медленно наберите 75 микролитров среды с краев лунок в первом ряду. Затем быстро вытолкните его обратно в лунку, чтобы извлечь свободные клетки и органоиды.

Повторите этот процесс дисперсии для каждого ряда. Подождите 15 секунд, чтобы убедиться, что органоиды опустились на дно каждой лунки, а затем медленно и осторожно отсасывайте 75 микролитров среды из каждой лунки с помощью многоканальной пипетки p200 и диспенсируйте ее в резервуар для отходов. Затем перенесите среду, содержащую ингибитор горных пород, в резервуар с реагентами, распределите по 150 микролитров среды в каждую органоидную лунку, а затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия.

Нагрейте 17 миллилитров свежей культуры до 37 градусов Цельсия, на этот раз без ингибитора горных пород. С помощью многоканальной пипетки p200, установленной на 100 микролитров, повторите показанный ранее процесс диспергирования и подождите 15 секунд, чтобы убедиться, что органоиды опустились на дно своих лунок. Затем тщательно отасуньте по 125 микролитров среды из каждой лунки и замените на 150 микролитров подогретой среды.

Поместите тарелку в инкубатор с температурой 37 градусов по Цельсию. Приготовьте среду по показанному здесь рецепту, а затем стерильно отфильтруйте смешанный раствор в фильтре объемом 500 миллилитров. С четвертого дня и до тех пор, пока клетки не будут инфицированы примерно на 24-й день, проводите регулярное техническое обслуживание через день с использованием нейроиндукционной среды.

После фильтрации нагрейте 17 миллилитров среды для нервной индукции до 37 градусов Цельсия и храните остальное при температуре четыре градуса Цельсия. С помощью многоканальной пипетки p200, установленной на 100 микролитров, диспергировать все лунки органоидной пластины, ранее показанной. Подождите 15 секунд, чтобы убедиться, что органоиды опустились на дно своих лунок.

Осторожно отсасывайте по 125 микролитров среды из каждой лунки и замените ее 125 микролитрами свежей среды для нервной индукции. Повторяйте этот подвиг индукции через день до тех пор, пока органоиды не будут готовы к заражению вирусом Зика. Добавьте 1x сбалансированный раствор соли Earle's, 1x PBS и среду для нейронной индукции до 37 градусов Цельсия в водяной бане.

Затем разведите вирус Зика известной концентрации в 1x растворе Эрла до целевой кратности инфекции, которая обычно составляет от 0,1 до 10. С помощью пипетки p200 тщательно удалите всю среду из каждой лунки органоида. Затем быстро промойте органоиды 200 микролитрами подогретого 1x PBS.

При извлечении среды из каждой лунки крайне важно не прикасаться к органоиду и не всасывать его в пипетку. Это может нанести непоправимый ущерб органоиду. Если это произойдет, лучше всего выбросить органоид.

Далее аккуратно удалите всю оставшуюся жидкость из каждой органоидной лунки с помощью одноканальной пипетки p200. Затем быстро добавьте в каждую лунку 50 микролитров раствора 1x earle's solution for mock infection или раствора вируса Зика. Убедитесь, что каждый органоид полностью погружен в воду, после чего поместите планшет обратно в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на два часа.

После того, как вирусное воздействие будет завершено, промойте каждую лунку от органоидов 200 микролитрами PBS. Дайте органоидам осесть в течение 15 секунд, а затем извлеките PBS с помощью одноканальной пипетки p200. Наконец, добавьте 200 микролитров свежей среды для нервной индукции в каждую лунку и поместите пластину обратно в инкубатор.

Окрашивание DAPI, фосфо-виментином, TBR2 и MAP2 можно комбинировать, чтобы показать корковые структуры, формирующиеся внутри органоидов. Эти структуры включают желудочковую зону, субжелудочковую зону, промежуточную зону и кортикальную пластину в пределах каждой розетки. Культивирование органоидов до 108-го дня позволяет наблюдать более поздние стадии развития.

В то время как корковая слоистость не так заметна у этого типа органоидов, естественное переключение к глиогенезу происходит так же, как и в естественных условиях. Через три дня после заражения вирусом Зика становится заметной разница в размерах органоидов. Масштаб этой разницы зависит от вирусной множественности инфекции, которая распространяется на органоиды.

Эта разница в размерах органоидов будет увеличиваться в течение следующей недели до тех пор, пока зараженные органоиды не начнут распадаться. Через три дня также будет наблюдаться увеличение клеточного мусора в инфицированных лунках по сравнению с имитационными колодцами. При попытке выполнить эту процедуру важно соблюдать безопасные лабораторные методы, поскольку используются жизнеспособные инфекционные материалы.

После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как иммуногистохимия или РНК, чтобы ответить на дополнительные вопросы о биологии, связанной с инфекцией вируса Зика, вызванной нейронным развитием вируса Зика.