Обработка тканей человека сердца к внеклеточного матрикса самостоятельной сборки Гидрогель для In Vitro и In Vivo приложений

Общей целью этой процедуры является переработка сердечного внеклеточного матрикса в гидрогель, что позволяет изучать влияние матрикса в различных клеточных анализах. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сердца, например, как внеклеточный матрикс влияет на поведение клеток. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она облегчает использование внеклеточного матрикса для проведения крупномасштабных экспериментов in vitro или in vivo.

Применение этого метода может быть расширено в отношении терапии инфаркта миокарда, поскольку матрица может обеспечить важные сигналы выживания. Для начала эксперимента с помощью стерильного скальпеля с лезвием номер десять можно удалить жировую ткань из ранее полученного миокарда левого желудочка. Разрежьте миокард кубиками примерно 1 на 1 на 1 см, используя скальпель.

Далее поместите кубики в стерильную пробирку объемом 50 мл. Храните пробирки с кубиками при температуре 80 градусов Цельсия. Достаньте тюбик с подготовленными кубиками из морозилки и транспортируйте его на льду в криостат.

Установите температуру объекта и камеры криостата на 15 градусов по Цельсию. Охладите пустые пробирки объемом 50 мл и штампы в камере. Добавьте слой криосекционного материала на холодный штамп и дайте ему застыть, пока он не станет белым и твердым.

Добавьте второй слой криосекционной среды и поместите трубку миокарда во второй слой. Убедитесь, что криосекционная среда и миокард полностью заморожены. Затем, вставьте штамп с замороженным миокардом в держатель и закрутите все винты.

Обрежьте поверхность ткани до получения ровной поверхности для разреза. Секционирование замороженного миокарда с помощью автоматического секционирования для обеспечения равномерных срезов. Из одного кубика можно нарезать примерно от 30 до 40 секций.

Поместите каждый ломтик после разрезания в предварительно охлажденную пробирку объемом 50 мл. Закройте заполненные трубочки и положите их на лед. Переложите замороженные срезы всех пробирок объемом 50 мл в одну стерильную мензурку.

Добавьте 50 мл раствора лизиса на 50 мл пробирки, содержащей срезы миокарда. Далее встряхните срезы миокарда в стерильном стакане. Процедите жидкость с кусочками ткани через ситечко грубой очистки.

Затем перенесите срезы ткани тупым пинцетом в новую стерильную мензурку. Добавьте 50 мл 0,5% SDS в PBS на начальную 50 мл трубки ломтиков миокарда. Непрерывно встряхивайте стакан в течение шести часов при 100-150 об/мин при комнатной температуре.

После встряхивания процедите жидкость с ломтиками салфеток через крупное ситечко. С помощью тупого пинцета переложите срезы салфеток в новый стерильный стакан и трижды промойте срезы 50 мл PBS. Затем промойте ломтики на ночь в PBS с 1% пенициллина стрептомицина и 1% нистатина.

На следующий день удалите моющий раствор и добавьте 25 мл FBS, предварительно нагретого до 37 градусов Цельсия с 1% пенициллина стрептомицина и 1% нистатина, в децеллюляризованные срезы на первоначальные 50 мл пробирки миокарда. Инкубируйте срезы в течение трех часов при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы удалить всю оставшуюся ДНК из матрицы. Затем переложите ломтики в новую стерильную мензурку и трижды промойте 50 мл PBS.

Свободно поместите ломтики ECM в новую стерильную шестилуночную пластину. Заморозьте ЭКМ при температуре 80 градусов Цельсия и лиофилизируйте его в течение двух дней в лиофилизированном состоянии. Для измельчения среза ECM используют фрезерные трубки, содержащие керамические шарики толщиной 1,4 мм.

Наполните пробирки лиофилизированным ЭКМ с помощью стерильного тупого пинцета. Застегните трубки в жидком азоте. Вставьте замороженные трубки в фрезерный станок и измельчите ECM.

Установите продолжительность 30 секунд, отрегулируйте максимальную скорость и запустите устройство. После измельчения выньте трубки и снова заморозьте их в жидком азоте. Промойте микрочастицы из пробирок, добавив 1 мл ddH20 на пробирку, и встряхните для полной солюбилизации.

Затем отфильтруйте гетерогенный раствор через ячейки 200 микрометров в пробирку объемом 50 мл. Заморозьте трубку в жидком азоте. Замените стандартную крышку тубы на фильтр 0,22 микрометра, чтобы предотвратить вытекание порошка из трубки.

Вставьте тюбик в лиофилизатор и снова сделайте лиофилизацию, чтобы удалить воду с этапа промывки. Растворите ранее приготовленный лиофилизированный порошок ВКМ человека в растворе пепсина, до конечной концентрации 10 мг/мл. Переложите раствор в 2 мл пробирки объемом 1 мл на пробирку.

Пипеткой раствор тщательно перемешать. Затем поместите трубки в шейкер и встряхивайте при 1200 об/мин в течение 48 часов при температуре 27 градусов по Цельсию. Выньте трубки из шейкера и поместите их на лед или в предварительно охлажденный держатель трубки.

Смешайте 1/9 объема раствора ЭХМ холода 10X PBS, с 1/10 объема раствора ЭХМ холодного 0,1 молярного гидроксида натрия, в предварительно охлажденной пробирке и положите его на лед для нейтрализации переваренного раствора ЭХМ и инактивации пепсина. Наконец, добавьте раствор ECM в нейтрализующую смесь и тщательно перемешайте с помощью пипетирования или вортексирования. Количественные анализы отдельных компонентов ВКМ показали более полное удаление ДНК и лучшее сохранение общего коллагена, эластина и гликозоминогликанов по сравнению с децеллюляризацией только SDS.

С помощью ОТ-ПЦР количественно оценивали экспрессию структурных белков кардиомиоцита, факторов ранней и поздней кардиомиогенной транскрипции и генов поверхностных маркеров эндотелиальных клеток в мышиной ЭСК, подвергающихся спонтанной дифференцировке. Контакт с цЭКМ приводит к образованию плюрипотентных стволовых клеток, предпочтительно в направлении фенотипа, подобного кардиомиоциту. Фазово-контрастная световая микроскопия показывает, что ферментативное расщепление цЭКМ в течение 48 часов приводит к получению более гомогенизированного раствора ВКМ.

Окрашивание живых/мертвых сердечных фибробластов человека гидрогелем cECM, показывает повышенную жизнеспособность. Как микрочастицы cECM, так и гидрогель cECM усиливают метаболическую активность сократительных клеток HL-1 в условиях ишемии по сравнению с клетками в стандартной культуре. После освоения этой техники ее можно выполнить в течение одной недели от ткани до гидрогеля, если она выполнена правильно.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области регенерации сердца, чтобы изучить эффекты сердечного внеклеточного матрикса, модельных систем in vitro и in vivo.