Методология для индукции мокроты и лаборатория обработки
17 декабря 2017 г.
Здесь мы описываем метод индукции мокроты. Этот протокол также объясняет обработки для выполнения счетчик дифференциального клеток и для сбора мокроты супернатанта мокроты и клетки для дальнейшего анализа.
Методика индуцированного отхождения мокроты была разработана в начале 90-х годов. Метод был предложен для изучения новой информации об обструктивных заболеваниях дыхательных путей, таких как астма, ХОБЛ, а в последнее время также возник интерес к изучению новой информации о фиброзе легких. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она относительно неинвазивна, в отличие от бронхоскопии.
Обработка требует лабораторной работы, и это требует времени, поэтому это довольно сложно, отнимает много времени, и для этого требуется некоторый опыт работы в лаборатории, так что очевидно, что это метод, который трудно получить в каждом центре. Техника индуцированного оттока мокроты состоит из двух частей, первая часть – индукция, а вторая – обработка. Перед тем, как вызвать отхождение мокроты, нам необходимо провести спирометрию, которая представляет собой оценку объема и скорости потока, которые пациент способен производить.
И нам нужно это сделать, потому что индукция мокроты сама по себе может вызвать бронхоспазм, поэтому нам абсолютно необходимо знать исходное значение спирометрии пациентов. Итак, сначала мы проводим спирометрию, затем мы даем пациентам бронходилататоры, обычно мы даем 400 мкг сальбутамола, чтобы максимально открыть дыхательные пути пациентов, а также предотвратить бронхоспазм, который может возникнуть во время фазы индукции. И через 15 минут мы снова измеряем спирометрию, чтобы получить то, что мы называем базовым значением спирометрии, и, в частности, мы смотрим на ОФВ1, который представляет собой объем, который пациент может выдохнуть в течение одной секунды.
Налейте в камеру небулайзера дистиллированную воду до рекомендованного уровня. Поместите чистую чашку в камеру небулайзера. Накройте заполненную крышку соответствующей крышкой.
Наполните чашку 50 мл гипертонического раствора 5%, если постбронходилататорный ОФВ1 превышает 65% прогнозируемого, или 50 мл изотонического раствора 9%, если постбронходилататорный ОФВ1 менее 65% прогнозируемого. Добавьте в чашку 1,75 раствора сульфата сальбутамола в концентрации пять миллиграмм на мл. Подсоедините трубки и клапаны в соответствии с инструкциями производителя.
Методика должна проводиться под наблюдением врача. Объясните пациенту принцип проведения теста. Попросите пациента использовать зажим для носа.
Запустите небулайзер и выберите самый низкий уровень аэрозоля и настройку вентилятора. Попросите пациента вдохнуть аэрозоль через мундштук с дыхательным дыханием. Уровень аэрозоля и настройка вентилятора могут быть увеличены в зависимости от переносимости пациента.
В случае стеснения в груди или респираторного дискомфорта следует прекратить процедуру и провести спирометрию для измерения величины ОФВ1 пациента. После пятиминутной ингаляции, или в случае кашля или тошноты, прекратите работу небулайзера. Попросите пациента снять зажим для носа, прополоскать рот и дважды прополоскать горло водой из-под крана, а затем вылить эту воду в раковину.
Затем по мере того, как больной откашливает мокроту и выплевывает то, что выходит из горла, в пластиковый контейнер. Выполните первый дыхательный маневр для измерения ОФВ1. После каждой попытки определения выработки мокроты мы измеряем значение ОФВ1.
Если значение ОФВ1 падает более чем на 20%, мы прекращаем процедуру и даем пациенту небулайзер ипратропия бромид, который является антихолинергическим средством, действующим в сочетании с бета-двумя агонистами, которые мы уже вводили во время процедуры. Если значение ОФВ1 не снижается более чем на 20%, мы проводим процедуру в течение 10-20 минут в зависимости от качества и объема мокроты, производимой пациентом. Как только вы получите образец мокроты, храните его в холодильнике до обработки.
Итак, вторая часть состоит из переработки мокроты, и для этого нам сначала нужно подготовить два раствора, которые мы будем использовать для этой обработки. Поэтому мы должны приготовить дитиотреитол, также известный как DTT. Раствор должен быть приготовлен путем разбавления ДТТ стерильной водой с целью получения 6,5 миллимолярного раствора.
Таким образом, вы должны избегать воздействия DTT на окружающий воздух, и для этого мы используем шприц и иглу. Во-вторых, вам нужно приготовить раствор трипанового синего, а для этого вам нужно сделать разбавление DPBS трипановым синим, чтобы получить раствор 0,08%. Что касается мокроты, вам нужно перенести всю мокроту в пластиковую пробирку с коническим дном объемом 50 мл и взвесить образец. Добавьте трехкратный вес раствора DPBS.
Медленно перебивайтеобразец вихрем в течение 30 секунд, центрифугируйте при 800 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Соберите надосадочную жидкость в пластиковую пробирку с коническим дном объемом 50 мл, после фильтрации через два одинарных слоя стерильной марли. Поместите надосадочную жидкость в пластиковые тубы объемом 2 мл и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия.
Отметим, что надосадочная жидкость полезна нам в качестве трехфазного компонента мокроты. Если объем клеточного поддона составляет менее 5 мл, добавьте DPBS, чтобы получить объем клеточной суспензии 5 мл. Разбавляют клеточную суспензию одним объемом DTT при 6,5 миллимоларе.
Раскачивайте клеточный подвес в течение 20 минут при комнатной температуре со скамьей рабочим. Разбавляют клеточную суспензию не менее трех раз с помощью DPBS. Центрифугируйте разведенную клеточную суспензию при 550 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
Выбросьте надосадочную жидкость. Подвесьте клеточную палитру примерно в одном мл DPBS. Оцените и запишите точный объем клеточной суспензии.
Добавьте 50 микролитров клеточной суспензии к 50 микролитрам разбавленного раствора трипанового синего и гомогенизируйте. Поместите образец под покровную крышку цитометра гемоцила, и поместите его под оптический микроскоп. Оцените клеточную концентрацию клеточной суспензии, процент плоскоклеточных клеток и процент жизнеспособности неплоскоклеточных клеток.
Разбавляют выделенную суспензию DPBS с получением не менее 350 мкл клеточной суспензии при концентрации 500 000 клеток на мл. Соберите концентратор элементов в соответствии с инструкциями производителя. Добавьте по 100 микролитров клеточной суспензии в каждый из трех отсеков клеточного концентратора.
Отжим две минуты при 150 г при комнатной температуре в цитоцентрифуге. Выбросьте надосадочную жидкость. Дайте предметному стеклу высохнуть на воздухе.
Покрасьте затвор с помощью div quick или набора для валентной морилки из никеля в соответствии с инструкциями производителя. Крепление с помощью монтажного носителя и крышки. Поместите предметное стекло под оптический микроскоп с масляными погружениями.
Подсчитайте не менее 500 неплоских клеток, нейтрофилов, эозинофилов, макрофагов, лимфоцитов и эпителиальных клеток, а также запишите абсолютные значения, процентное соотношение и тип клеток. Что касается результатов, то с помощью гемоцитометра мы должны подсчитать живые неплоские клетки, которые не окрашены. Также мертвые неплоскоклеточные клетки, которые окрашены в синий цвет.
И плоскоклеточные клетки. Эти клетки представляют собой эпителиальные клетки, которые поступают изо рта. Они большие, поэтому их легко узнать по сравнению с маленькими клетками человека.
Таким образом, вы должны избегать подсчета бактерий, дрожжей или лома. Если клеточная суспензия содержит более 80% плоских клеток, этот образец считается некачественным и непригодным для цитоспинового предметного стекла. Поэтому данная выборка считается неудачной.
Подсчет окрашенного цитоспина производится в соответствии с цветом клеток и их морфологией. Что касается нейтрофилов, то главной характеристикой является многодольчатое ядро, что делает клетки легко идентифицируемыми. Эти клетки круглые, маленькие и окрашены в нейтральный розовый цвет.
Эозинофилы, эти клетки, состоят из красных гранул, которые легко идентифицировать. Размер этих клеток близок к нейтрофилам. Макрофаги, они в два-пять раз больше нейтрофилов, и окрашены в синий цвет.
Цитоплазма может содержать мусор и вакуоли. Лимфоциты, эти клетки, круглые и маленькие, окрашены в синий цвет и обладают большим и плотным ядром. Клетки эпителия имеют столбчатую форму, окрашены в розовый цвет, и часто присутствуют реснички на верхушке.
Вот несколько примеров нечитаемых образцов цитоспина с более чем 80% плоских клеток. Я думаю, что это очень полезная методика, однако мы должны быть очень осторожны, потому что индукция мокроты должна проводиться под наблюдением врача, но техника индукции мокроты дает много информации о воспалительном статусе пациентов в дыхательных путях. Он может позволить вам измерять различные биохимические маркеры в надосадочной жидкости, а также вы можете измерять различные вещи на клеточных участках, поэтому индуцированная мокрота позволяет выполнять проточную цитометрию, протеомику, транскриптомику и даже геномику.
Обзор
В данной статье описывается метод индуцированного откашливания — неинвазивный способ сбора образцов мокроты для анализа при респираторных заболеваниях. Протокол включает подробные этапы обработки мокроты для проведения дифференциального подсчета клеток и сбора супернатанта для дальнейшего исследования.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Респираторная медицина
- Клинические методы
- Клеточный анализ
Обзор
- Метод индуцированного мокротки был разработан в начале 90-х годов.
- Используется для исследования обструктивных заболеваний дыхательных путей, таких как астма и ХОБЛ.
- Недавний интерес к легочному фиброзу.
- Неинвазивная альтернатива бронхоскопии.
Цель исследования
- Предоставить детальный протокол индукции и обработки мокроты.
- Обеспечить сбор образцов мокроты для клеточного анализа.
- Углубить понимание респираторных заболеваний посредством анализа мокроты.
Используемые методы
- Проведите спирометрию для оценки исходного состояния функции легких.
- Вводите бронхолитики для предотвращения бронхоспазма во время индукции.
- Спровоцируйте выделение мокроты с помощью гипертонического раствора физиологического раствора и небулизации.
- Обработайте образцы мокроты для дифференциального подсчета клеток и сбора супернатанта.
Основные результаты
- Успешный сбор образцов мокроты для анализа.
- Подробное описание методики обработки мокроты.
- Проведенная оценка жизнеспособности и концентрации клеток.
Выводы
- Метод индукции мокроты эффективен для неинвазивного сбора образцов.
- Правильная обработка мокроты имеет решающее значение для точного анализа.
- Данный протокол может быть полезен при проведении исследований и клинической диагностике респираторных заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Индукция и обработка мокроты представляют собой неинвазивный метод сбора клеток дыхательных путей и супернатанта, позволяющий проводить механистические исследования путей воспаления при респираторных заболеваниях. Данный подход способствует валидации мишеней, предоставляя количественные клеточные и биохимические данные из микроокружения легких, что имеет критическое значение для снижения рисков при проверке гипотез в исследованиях астмы, ХОБЛ и фиброза. Этот метод повышает прогностическую достоверность доклинических моделей, связывая анализ клинических образцов с функциональным исследованием мишеней.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного определения популяций иммунных клеток (нейтрофилов, эозинофилов, макрофагов, лимфоцитов, эпителиальных клеток) в просвете дыхательных путей.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимый дифференциальный подсчет клеток и оценку их жизнеспособности с использованием стандартизированных методов с гемоцитометром и исключением трипанового синего.
- Научная ценность: способствует снижению механистических рисков путем анализа супернатанта мокроты на наличие медиаторов и клеточных компонентов для последующей проточной цитометрии, геномики или протеомики.
Скрининг и разработка анализа
- Практическая ценность: Подготовка валидированных биологических систем (суспензии клеток и супернатанта) для последующих анализов с помощью определенных этапов обработки, включая муколиз с использованием DTT и центрифугирование.
- Научная ценность: Получение количественных показателей, таких как концентрация клеток (целевой показатель: 500,000 cells/mL) и процент жизнеспособности, что обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость анализа.
- Практическая ценность: Обеспечение готовности к скринингу за счет хранения супернатанта при -80°C для анализа биомаркеров и использования концентратора клеток для подготовки предметных стекол.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: связывает стадию открытия с доклинической непрерывностью путем анализа профилей воспалительных клеток в системах, релевантных заболеванию (астма, ХОБЛ, pulmonary fibrosis).
- Операционная ценность: обосновывает решения о продвижении проекта с учетом рисков с помощью порогов контроля качества (например, <80% squamous cells), чтобы обеспечить пригодность образцов для цитоспина и последующего анализа.
- Научная ценность: подчеркивает согласованность трансляционных биомаркеров, обеспечивая измерение биохимических маркеров в супернатанте и клеточных фенотипов, связанных с механизмами заболевания.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрирован в общий процесс исследований — от проверки гипотез до идентификации перспективных соединений (лидов), обеспечивая анализ воспаления дыхательных путей и приоритизацию мишеней на основе биомаркеров в программах изучения респираторных заболеваний.
- Биология открытий: обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей передачи сигналов путем количественного определения типов клеток и медиаторов в индуцированной мокроте, что отражает статус воспаления дыхательных путей.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированной обработки: разведения DTT (6,5 mM), окрашивания трипановым синим (0,08%), центрифугирования (800 g и 550 g) и доведения концентрации клеток до 500,000 cells/mL.
- Аналитика: позволяет проводить сравнительный анализ посредством дифференциального подсчета клеток (нейтрофилов, эозинофилов и др.), оценки жизнеспособности и сбора супернатанта для измерения биохимических маркеров.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническими исследованиями за счет профилирования клеток, значимых для патологии астмы, ХОБЛ и фиброза, что способствует согласованию биомаркеров и валидации механизмов.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность многократного применения методики для лонгитюдного мониторинга воспаления и валидации мишеней при различных респираторных заболеваниях посредством стандартизированной индукции и обработки мокроты.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности за счет количественного профилирования воспаления и устранение механистической неопределенности в моделях заболеваний дыхательных путей.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость благодаря определенным концентрациям реагентов (DTT 6.5 mM, трипановый синий 0.08%), параметрам центрифугирования и целевым показателям концентрации клеток.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних стадиях за счет получения ранних релевантных для человека данных о воспалении с помощью неинвазивного отбора проб.
- Влияние на портфель: Приоритизация с учетом рисков и решения о продвижении проектов на основе воспроизводимых дифференциальных подсчетов клеток и уровней биомаркеров в супернатанте, указывающих на взаимодействие с мишенью или модуляцию сигнального пути.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области физиологии дыхания, работы с клетками и микроскопического анализа для точного проведения спирометрии, мониторинга индукции и подсчета клеток.
- Необходимо наличие оборудования для небулизации, центрифуги (800 g и 550 g), гемоцитометра, цитоцентрифуги и морозильника с температурой -80°C для хранения супернатанта.
- Требуется межгрупповая стандартизация этапов обработки: приготовление DTT без воздействия воздуха, разведение трипанового синего, выбор физиологического раствора на основе ОФВ1 после применения бронхолитиков и соблюдение времени муколиза (20 мин при покачивании).
- Предусмотрены аспекты адаптации: тоничность раствора (5% гипертонический или 9% изотонический) корректируется в соответствии с ОФВ1 пациента, а процедура обработки модифицируется, если объем клеточного осадка составляет <5 mL (добавление DPBS).
- Существуют практические ограничения: высокая техническая сложность, значительные затраты времени, необходимость медицинского наблюдения и исключение образцов, если содержание плоскоклеточных клеток составляет >80%, что указывает на загрязнение слюной.
