Улавливание активно производимых микробных летучих органических соединений из образцов, связанных с человеком, с помощью вакуумной экстракции сорбента

Этот протокол позволяет нам легко концентрировать и идентифицировать летучие метаболиты и активно продуцируемые летучие вещества из микробных организмов в различных биологических образцах. VASE является более удобным для пользователя методом концентрации летучих веществ с низким содержанием. Все, что вам нужно, это образец под почти вакуумом, и пусть физика сделает все остальное.

Доступ к летучему анализу клинических образцов имеет важное значение для обнаружения метаболических биомаркеров в ряде различных болезненных состояний. Например, патогенное вождение и инфекция или успех антибактериальной терапии могут быть обнаружены с помощью летучего анализа образцов слюны, мокроты или дыхания. Для подготовки образцов фекалий добавьте один миллилитр деионизированной воды к 100 миллиграммам кала в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку и вихрь в течение трех минут.

Храните образцы на льду, когда они не используются. Добавьте 485 миллилитров среды BHI с 20-миллимолярной глюкозой 13C или BHI с 30% дейтерия до 15 микролитров фекальной и водной смеси, гарантируя, что конечный объем образца составляет 500 микролитров. Подготовьте образцы в технических трех экземплярах.

Для подготовки образцов сточных вод добавьте 500 микролитров сточных вод к 500 микролитрам среды BHI с 13C глюкозой или 30% дейтерия общим объемом в один миллилитр. Подготовьте образцы в трех экземплярах и держите их на льду. Для приготовления образцов слюны добавьте 50 микролитров слюны к 500 микролитрам среды BHI с глюкозой 13C или 30% дейтерия общим объемом 550 микролитров.

Подготовьте образцы в трех экземплярах и держите их на льду. Чтобы подготовить образцы мокроты, добавьте в флакон 15 микролитров мокроты. Подготовьте образцы в трех экземплярах и держите их на льду.

Поместите пустые флаконы «Голоса Америки» на холодную тарелку и поместите холодную пластину на лед в вытяжку биобезопасности. Включите 5600 SPEU и отрегулируйте его до требуемой температуры. Маркировка 20-миллилитровых флаконов VOA в соответствии с образцами, репликами и идентификаторами HSP с использованием водостойкого маркера, который сопротивляется воде в случае образования конденсата на внешней стороне флакона во время нахождения на льду.

Внутри капюшона биобезопасности открутите белый колпачок на флаконе, быстро поместите образец пипетки во флакон и соберите вкладыш крышки, черный колпачок и HSP. Поместите флакон, содержащий образец и HSP, обратно на холодную пластину. После того, как все образцы будут подготовлены в стеклянных флаконах, включите вакуумный насос, поместите флаконы под вакуум и удалите источник вакуума.

Дважды проверьте давление после помещения всех образцов под вакуум с помощью манометра. Если флакон протекает, убедитесь, что колпачок плотно прикручен и что белые уплотнительные кольца HSP и вкладышей крышки правильно установлены. Поместите флаконы в SPEU для оптимизации времени и температуры с перемешиванием при 200 об/мин.

Извлекайте культуры в течение одного часа при 70 градусах Цельсия и извлекайте стабильные эксперименты по зондированию изотипа с образцами фекалий, сточных вод, слюны и мокроты в течение 18 часов при 37 градусах Цельсия. Поместите холодную пластину при минус 80 градусах Цельсия для использования после завершения периода экстракции. Когда экстракция будет завершена, поместите образцы на холодную пластину на 15 минут, чтобы вытянуть водяной пар из HSP и пространства над головой флакона, а затем перенесите HSP на рукава.

Настройте последовательность образцов в программном обеспечении Entech. Откройте программу и выберите 5800 и Sequence в опциях справа от выпадающего меню Инструмент. Сохраните таблицу последовательностей, выберите Выполнить слева, а затем Начните с пустого в Десорбере, если пустой HSP не является десорбером.

Обратите внимание, что HSP будут обрабатываться SPR для каждого образца в последовательности. Пусть SPR разогреется. Разрешите SPR автоматически запускать все образцы.

Последовательность на стороне GC-MS автоматически записывает данные в отдельные файлы. Добавьте пик к методу обработки, выбрав «Калибровка», а затем «Изменить соединение», «Имя» и «Вставить соединение» в разделе «Внешнее стандартное соединение». Добавьте название соединений, время удержания и квантовый сигнал целевого иона.

Добавьте три самых больших пика, которые включают соединения с вероятностью более 75%, гарантируя, что выравнивание каждого идентифицирующего иона соединения лежит в центре пика. Сохраните его, выбрав OK, а затем Метод и Сохранить. После настройки метода процесса перейдите к параметрам Quantitate and Calculate, затем View and QEDIT Quant Result (Просмотр и QEDIT Quant Result) для количественной оценки данных.

Здесь вакуумная экстракция сорбента сопровождалась термической десорбцией на GC-MS для обследования летучих профилей бактериальных моно- и кокультур и выявления активно продуцируемых летучих веществ со стабильным изотопным зондированием из человеческих фекалий, слюны, сточных вод и образцов мокроты. Моно- и кокультуры состояли из видов бактерий staphylococcus aureus, pseudomonas aeruginosa и acinetobacter baumannii. 43 аннотированные летучие молекулы были обнаружены из моно- и ко-культур в 24- и 48-часовых временных точках.

Было больше включения 13C в полностью меченые летучие молекулы по сравнению с дейтерием. 13C был включен в 2-бутанон, 3-гидрокси, 2, 3-бутандион диацетил, уксусную кислоту и фенол для всех образцов фекалий, сточных вод и слюны. Ацетон, бутановая кислота и пропановая кислота были обнаружены как меченые в слюне и сточных водах.

в то время как диметилтрисульфид и дисульфид диметил были обогащены как в образцах фекалий, так и в образцах слюны. Летучие вещества 1-пропанол, 2-бутанон, бензофенон, этанол и метилтиол ацетат обогащались только в сточных водах и 2, 3-пентандион в слюне. Дейтерий был включен в летучие вещества уксусной кислоты, бензальдегида, 4-метил-диметилтрисульфида и фенола из образцов слюны или сточных вод.

Уксусная кислота, диметилтрисульфид, ацетон и пропанол 2-метил были более распространены в культивируемых образцах мокроты, чем в образцах некультурной мокроты. Перестановочный многомерный анализ вариантов, PERMANOVA, был выполнен на матрице расстояний Брея-Кертиса летучих изобилий из образцов мокроты муковисцидоза. Мы обнаружили, что субъект, который пожертвовал образец, объясняет 51% вариаций в 13C-меченой культивируемой мокроте и 33% вариации в некультурной мокроте.

Здесь показан успех маркировки стабильных изотопов глюкозой 13C в летучих веществах из образцов культивируемой мокроты, собранных у семи человек с муковисцидозом. Летучие вещества, которые имеют более высокую инкорпорацию 13C для большинства образцов, показаны на панели 5A, те, которые имеют более низкопроцентное включение 13C в большинстве образцов мокроты, находятся в панели 5B, а молекулы с более низким процентным преобразованием 13C в меньшинстве образцов мокроты показаны на панели 5C. Всегда дважды проверяйте давление во флаконах примерно через минуту.

Сломанный вакуум снижает чувствительность и скорость метода VASE. После этой процедуры, если было проведено зондирование стабильных изотопов, ДНК может быть извлечена из оставшегося материала для идентификации микробных организмов или видов, которые могли способствовать производству летучих молекул. Этот метод также полезен при обнаружении летучих веществ из любого типа образца без изотопного зондирования.

Благодаря преимуществам чувствительности и низкому объему образца многие приложения могут извлечь выгоду из этого метода.