Быстрое обнаружение фенотипов исходам в клетках человека нейронных прекурсоров (НПС)

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы быстро и воспроизводимо охарактеризовать процессы раннего развития мозга человеческих нервных клеток-предшественников, а также определить влияние важных внеклеточных факторов на регуляцию этих процессов. Этот метод может помочь решить важные вопросы в области нейропсихиатрии и расстройств развития нервной системы, такие как имеют ли все пострадавшие люди одну и ту же клеточную аномалию или, наоборот, проявляет ли каждый из них специфическую дисфункцию человека? Основное преимущество нашего протокола заключается в том, что он быстрый, высоковоспроизводимый и простой в реализации.

Хотя этот метод может быть использован для получения представления о нарушениях развития нервной системы, он также может быть использован для изучения нейродегенеративных и нервно-психических расстройств, таких как болезнь Альцгеймера и депрессия. Визуальная демонстрация некоторых из этих методов необходима, поскольку некоторые методы предполагают перемещение клеток из одной чашки в другую или требуют морфологического анализа, который лучше всего передается через визуальную демонстрацию. Чтобы поднять человеческие нервные клетки-предшественники, аспирируйте среду и промойте клетки один раз 1X фосфатным буферным раствором.

Аспирируйте фосфатно-солевой буфер и добавьте 500 микролитров раствора 1X для отслоения клеток в лунку с нейральными клетками-предшественниками. Затем инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. Затем с помощью пипетки P1000 добавьте 500 микролитров фосфатно-солевого буфера, поддерживаемого при комнатной температуре, чтобы промыть и удалить клетки.

Затем перенесите клетки в фосфатно-солевом буфере в 15-миллилитровую коническую пробирку. Снова промойте лунку одним миллилитром фосфатного буферного раствора и переложите промывку в трубку. Затем вращайте ячейки при 300 G в течение пяти минут, чтобы сформировать гранулу.

Затем выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в одном-пяти миллилитрах предварительно подогретой среды DMEM F12. Планшет 100 000 ячеек в тройных лунках в 24-луночном планшете. Через 46 часов добавьте тритиированный тимидин в питательную среду и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов.

Затем, после удаления среды, добавьте 300 микролитров предварительно подогретого 0,25% трипсина ЭДТА и инкубируйте в течение 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы разбить клетки на части и высвободить ДНК. Затем включите комбайн и насос. Поместите фильтровальную бумагу в комбайн для клеток.

Продолжайте собирать пробирки комбайна в пустой пустой лоток. Затем нажмите на предварительную промывку, чтобы намочить фильтровальную бумагу. Поместите сборные трубки в лунки для отбора проб и приступайте к работе.

Используйте источник горячего света для сушки фильтровальной бумаги и разложите соответствующие флаконы на лотке. Выбейте в флаконы бумажные чады, а затем добавьте в каждый флакон по два миллилитра жидкого сцинтилляционного коктейля. Инкубируйте флаконы в течение одного часа в сцинтилляционном счетчике перед использованием машины, чтобы получить количество в минуту каждого образца, которое отражает активный синтез ДНК.

Посадите 500 000 клеток в 35-миллиметровую чашку для культивирования. Затем взбалтывайте посуду во всех направлениях, чтобы равномерно распределить ячейки. Далее инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 46 часов.

Затем добавьте в культуру два микролитра на миллилитр пяти миллимоляров EdU и инкубируйте в течение двух часов. Далее диссоциируйте и гранулируйте клетки. К клеточной грануле добавьте три миллилитра среды 30%-ного расширения с факторами роста или лекарствами или без них.

Нанесите один миллилитр клеточной суспензии на предварительно покрытую поверхность посуду и инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. Для изучения количества нейральных клеток-предшественников в культуре через два дня пробирки маркируют и подготавливают микроцентрифужные пробирки. Затем отсадите среду из лунки и добавьте 200 микролитров раствора для отслоения клеток 1X и инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.

После отделения клеток добавьте 300 микролитров 1X фосфатного буферного раствора в каждую лунку. Используйте пипетку P1000 для дозирования раствора ячеек несколько раз и отсоедините элементы от пластины. Затем перелейте клеточный раствор в подготовленную 1,5-миллилитровую пробирку и переверните трубку два-три раза.

С помощью пипетки извлеките 50 микролитров клеток наполовину по пробирке и добавьте в раствор трипанового синего в 0,5-миллилитровой пробирке. Затем подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Чтобы сформировать нейросферу, пипетку нанесите один миллилитр среды 100% расширения в 35-миллиметровую чашку без какой-либо покрывающей подложки.

Затем добавьте по миллиону нейральных клеток-предшественников в каждую из этих пластин и инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение 48-96 часов. Чтобы подготовить пластину к миграции нейросферы, растворите аликвоты ЭКМ-имитирующего геля в шести миллилитрах среды с 30%-ным расширением. Добавьте один миллилитр ЭКМ-мимического геля с 30%-ной средой расширения в одну лунку шестилуночного планшета.

Затем инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Чтобы покрыть нейросферы, с помощью пипетки соберите клетки в среде из 35-миллиметровой чашки и перенесите их в коническую трубку. Затем вращайте трубку при давлении 100 G, чтобы гранулировать нейросферы.

Затем повторно суспендируйте гранулу в одном-трех миллилитрах предварительно подогретой среды с 30% расширением. Затем пипетку 200 микролитров ресуспендированных нейросфер в шестилуночный планшет, содержащий ЭКМ-имитирующий гель со средой расширения 30%, и покачайте планшет. Затем инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 48 часов.

Аспирируйте гель, имитирующий ECM, с 30% расширяющей средой, а затем зафиксируйте клетки на 30 минут с помощью 4% параформальдегида. Чтобы проанализировать нейросферы, захватывайте изображения с использованием настроек фазового контраста при 10-кратном увеличении. Используйте программное обеспечение NIH ImageJ для измерения средней миграции нейросфер.

В ImageJ используйте инструмент «Линия от руки», чтобы обвести внешний контур нейросферы. Затем используйте функцию measure для вычисления площади трассировки и трассировки внутренней массы ячейки сферы. Вычтите внутреннюю клеточную массу из общей площади нейросферы, чтобы количественно оценить среднюю миграцию.

Иммуноцитохимическое окрашивание проводилось для изучения экспрессии белков цитоскелета и факторов транскрипции, таких как SOX2, PAX6 и нестин, в клетках-предшественниках нервов на третьем пассаже. Затем были получены фазово-контрастные изображения для идентификации клеток, несущих нейриты. Как видно из изображения, клетки с отростками, равными или длиннее двух клеточных тел, считаются несущими нейриты, в то время как клетки с отростками короче двух клеточных тел не считаются несущими нейриты.

Чтобы подтвердить формирование нейросферы, были получены фазово-контрастные изображения, которые показывают, что нейросферы, собранные в 72-часовой временной точке, имеют размер от 80 до 120 микрометров и, следовательно, могут быть использованы для анализа миграции. Чтобы определить пролиферативную способность, нейронные клетки-предшественники выращивали в условиях контроля или фактора роста фибробластов и окрашивали на наличие EdU. Фазово-контрастные флуоресцентные изображения показывают, что клетки, обработанные фактором роста фибробластов, имеют более высокую долю клеток, участвующих в S-фазе, как показано при окрашивании EdU.

Затем, чтобы проверить рост нейритов, клетки были проанализированы в контрольных условиях и сравнены с PACAP. Были получены фазово-контрастные изображения, которые показывают увеличение числа клеток с нейритами при лечении PACAP. Затем, чтобы понять миграцию нейросферы, клетки были обработаны нейропептидами PACAP.

Полученные фазово-контрастные изображения показывают повышенную миграцию нейросферы по сравнению с контролем. Наш протокол содержит множество методик и анализов, каждый из которых требует разного количества времени. После освоения среднего теста на подготовку анализа может уйти от двух до трех часов, а на анализ — от 30 минут до трех часов.

При выполнении этих процедур очень важно убедиться в том, что вы используете высококачественные нейронные клетки-предшественники, и что эти клетки полностью диссоциированы и равномерно распределены во всех условиях, за исключением анализа нейросферы. После этих процедур могут быть проведены другие анализы, включая вестерн-блоттинг, QRT-ПЦР, транскриптомику, протеомику и метаболомику, чтобы охарактеризовать основные механизмы. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.