Эффективное Вывод прав нейронов и нейронов прародителей из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с малыми Индукционная Молекула

Общая цель данного эксперимента заключается в получении нейронального потомства непосредственно и исключительно из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с использованием индукции малых молекул. Это достигается путем добавления реттиновой кислоты к недифференцированным клеткам, поддерживаемым в определенных условиях. Затем процесс дифференцировки продолжается путем отделения клеток в суспензионной культуре, где они образуют плавающие клеточные кластеры, называемые нейробластами.

Если позволить нейробластам прикрепляться к тканевой культуральной пластине в нейродифференцировочных средах, они развивают характеристики зрелых нейронов. В конечном счете, иммунофлуоресценция и деконволюция или конфокальная микроскопия могут быть использованы для демонстрации эффекта лечения реттиновой кислотой в морфологии и экспрессии маркеров обработанных эмбриональных стволовых клеток человека. В других методах только небольшая часть клеток преследует нейронный фенотип, в то время как наш метод позволяет хорошо контролируемую эффективную индукцию плюрипотентных человеческих эмбриональных стволовых клеток исключительно в направлении нейронной линии путем простого предоставления малых молекул.

Есть несколько шагов, с которыми следует быть осторожным при ремонте стоковых растворов. Следите за медленным размораживанием матери и человеческого ламинина с минус 80 градусов Цельсия до четырех градусов Цельсия в течение ночи, храните среду при температуре четыре градуса Цельсия и всегда нагревайте среду до 37 градусов Цельсия перед использованием. Кроме того, при приготовлении человеческой среды ESL некоторые добавки добавляются непосредственно перед ее использованием.

К ним относятся BFGF, аскорбиновая кислота, человеческий инсулин, активный в А и транспортный. Далее сделайте рабочие растворы для геля матры или человеческого ламинина непосредственно перед нанесением покрытия на пластины. Инкубируйте планшеты при 37 градусах SIU в 5% углекислом газе После того, как желатином предварительно покрыты тканевые культуральные планшеты.

Желатин можно заменить рабочим раствором матригеля или ламинина. Покройте эти пластины, инкубируя их в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. Начните с того, что дайте человеческим колониям клеток ES расти в течение пяти-семи дней, а затем подготовьтесь к делению.

Некоторые из них выбирают колонии с более чем 75%Ниже дифференцированных человеческих ES-клеток, они обычно слегка непрозрачны с определенными краями, колонии содержат нагроможденные клетки. Признаком начала дифференцировки обычно являются белые колонии, содержащие в основном дифференцированные клетки, обычно кажутся прозрачными. Не выбирайте белые или чистые колонии.

Поднесите пластины к свету и с помощью маркера обведите слегка непрозрачные колонии в нижней части пластин вдоль контуров. Используйте край стерильного наконечника для двух пипеток P для отделения окружающего слоя фибробластов от колонии ES-клеток человека. Затем удаляют окружающие клетки фибробластов и также удаляют все дифференцированные части колонии.

Теперь отсасывайте старую среду, содержащую отделенные дифференцированные клетки. Далее в каждую лунку промывают недифференцированные клетки по одному разу человеческими E-э-клеточными средами, в которых отсутствует BFGF, а затем добавляют три миллилитра свежей человеческой ESL-среды, содержащей B-F-G-F-B-F-G-F, добавляют в свежую среду непосредственно перед использованием. Теперь с помощью стерильного наконечника для двух пипеток P разрежьте колонии на небольшие кусочки и отсоедините их от пластины.

Вытяните отделившиеся кусочки колонии в их среду в коническую трубку объемом 50 миллилитров. Вытяните дополнительный. Миллилитровый материал промыть на лунку.

Теперь клетки готовы к дальнейшей дифференцировке с помощью малых молекул. Начните с нагревания свежепокрытых тарелок до 37 градусов по Цельсию. Отсадите из пластин защитный раствор и добавьте в каждую лунку по четырем миллилитровым алквотам среды, содержащей колонии, затем аккуратно перенесите пластины в инкубатор, не встряхивая их.

Не тревожьте пластины, чтобы они дали прорасти семена. После посева в течение трех дней вносят новые среды, содержащие оминовую кислоту. Затем удалите большую часть старой среды, оставив ровно столько среды, чтобы ячейки оставались погруженными.

Ни в коем случае нельзя допускать пересыхания клеток до каждого. Хорошо Добавьте четыре миллилитра свежей среды для ЭС клеток человека с BFGF и реттиновой кислотой. Заменяйте среду через день и дайте расти колониям человеческих ES-клеток, обработанных реттиновой кислотой.

Через семь или восемь дней клетки претерпевают морфологические изменения и превращаются в большие дифференцированные клетки. Затем приступайте к созданию суспензионной клеточной культуры, чтобы сделать суспензию, начните с отделения колоний ESL от клеток, которые спонтанно дифференцировались и мигрировали, образуя слой фибробластов. Используйте вышеупомянутую технику со стерильным наконечником для пипетки, затем отсасывайте старую среду, содержащую плавающие отслоившиеся клетки фибробластов.

Промойте клетки один раз фильтрующим материалом HESC и повторно суспендируйте их в трех миллилитрах фильтрующего материала HESC. Теперь с помощью стерильного наконечника P два пипетки. Нарежьте колонии небольшими кусочками и отсоедините их от тарелки.

Натяните среду с отделившимися колониями в одну коническую трубку объемом 50 миллилитров. Промойте лунки одним миллилитром среды и добавьте ополаскиватель в бассейн. Затем залейте по четыре миллилитра объединенных клеток в каждую лунку из шести лунок сверхнизкой прикрепляемой пластины в течение четырех-пяти дней, держите пластину в инкубаторе.

В течение этого времени будут формироваться плавающие клеточные кластеры или нейробласты для дальнейшего продвижения нейробласта к более зрелому фенотипу нейронов. Вытяните содержащую их среду в коническую трубку объемом 50 миллилитров. Затем центрифугируйте ячейки со скоростью 1 400 об/мин в течение пяти минут.

Отбирайте, взвешивайте как можно больше старых сред и добавляйте равное количество свежих сред NSC, содержащих VEGF N NT three и BDNF. Смешайте клетки в суспензию методом пипетирования, затем аликвотируйте четыре миллилитра суспензии на лунку на шесть. Хорошо тарелки для культивирования тканей переносят планшеты в увлажненный инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия.

Нейробласт будет прикреплен к культуральным планшетам на ночь для 3D-культуры в Matrigel или человеческий ламинат к суспензии нейробласта. А 3D-матрица будет полимеризоваться при 37 градусах Цельсия. Заменяйте носители через день.

В течение двух недель обширные сети нейронных клеток, несущих нейриты, и пигментных клеток станут достаточными, чтобы индуцировать человеческие ЭС-клетки, содержащиеся в определенной культуральной системе, перейти от исключительно плюрипотентности к нейроэпидермальному фенотипу. При воздействии ретиноевой кислоты на недифференцированные человеческие E-es клетки все клетки внутри колонии претерпевали морфологические изменения в большие дифференцированные клетки, которые переставали экспрессировать плюрипотентный маркер OCT 4. Клетки также начали экспрессировать различные маркеры, связанные с нейроэктодермой, такие как HNK one a, P two и TRKC.

Эти большие дифференцированные клетки продолжали размножаться, и колонии увеличивались в размерах, спонтанно экспрессируя ранний нейрональный маркер бета-3 тубулин. Более зрелая карта нейронных маркеров номер два начала появляться в тех областях колоний, где накопились клетки. По совпадению, с появлением нейроэктодермальных клеток нейронный специфический фактор транскрипции NER one участвует в дофаминергической дифференцировке нейронов и активации гена тирозингидроксилазы, транслоцированного в ядро.

После отслойки, обработанные реттиновой кислотой человеческие ЭС-клетки образовывали нейробласт в суспензионной культуре при удалении основного FGF, и после того, как нейробласту было позволено прикрепиться к тканевой культуральной пластине, обширные сети нейрональных клеток, несущих нейриты, и пигментных клеток, типичных для ЦНС, начали проявляться с резким увеличением эффективности и могли культивироваться в течение трех месяцев. Эти нейронные клетки, полученные из ЭС-клеток человека, экспрессировали бета-3 тубулин по сравнению со спонтанной мультилинейной дифференцировкой клеток без обработки реттиновой кислотой и коэкспрессированной картой 2 после освоения. Этот метод может быть использован для получения нейрональных предшественников в нейрональных клетках равномерно из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека примерно за четыре недели, если он выполнен правильно.

Не забывайте, что работа с клетками человека может быть чрезвычайно опасной, и перед выполнением этой процедуры всегда следует принимать меры предосторожности, такие как отсутствие патогенов и микоплазмы в клеточных линиях.