Мышь жировой ткани сбора и обработки для анализа РНК

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы обеспечить адекватный сбор образцов депо белой жировой ткани у различных мышей и выделить большое количество РНК хорошего качества из ткани. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области метаболизма, биохимии и молекулярной биологии, которые, например, относятся к экспрессии генов в жировой ткани обработанных или генетически модифицированных мышей. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет выделить большое количество РНК хорошего качества из жировой ткани, которая обычно имеет низкое содержание РНК.

Демонстрировать процедуру будет Эмили Пепин, научный сотрудник моей лаборатории. После усыпления мыши разрежьте кожу над белой линией согласно текстовому протоколу, затем сделайте два разреза примерно в два сантиметра от середины грудной клетки в сторону правой руки и близко к половым органам над правой задней конечностью. Растяните один уголок открытой кожи и с помощью иглы 22-го калибра прикрепите его к подушечке.

Затем закрепите другой угол. С помощью хирургических ножниц, расположенных на коже как можно ровнее, проведите тупое рассечение брюшной подкожной клетчатки, или СКФ, затем перенесите его на предварительно вырезанный кусок алюминиевой фольги. Повторите вскрытие для левой стороны животного.

Затем потяните левую и правую собранные жировые прокладки в алюминиевую фольгу и используйте жидкий азот для замораживания образца. Чтобы получить доступ к висцеральной жировой ткани, разрежьте мышцу живота по белой линии. Затем сделайте разрез в мышцах живота от гениталий по направлению к спине мыши с обеих сторон.

Жир вокруг репродуктивных органов — это перигонадный жир, или PGF. Отсоедините левый и правый жировые пакеты от придатка яичка, яичек и протока и перенесите их на предварительно маркированную алюминиевую фольгу. Затем заморозьте образец в жидком азоте.

Начиная с левой стороны, обнажите почки, переместив кишечник от брюшной полости к правой стороне. Жировая ткань, окружающая почки и надпочечники, представляет собой околопочечный жир, или PRF. Изолируйте и удалите надпочечники перед сбором PRF.

Это может быть утомительно, так как они немного розовее, чем жировая ткань. Теперь изолируйте PRF от задней мышечной стенки и перережьте мочеточник, почечную артерию и вену, которая отделяет PRF и почку от остальной части тела. Затем изолируйте PRF от почки, разрезав и удалив почечную капсулу.

После выделения правого PRF перенесите образец на алюминиевую фольгу с тканью с левой стороны и используйте жидкий азот для замораживания образцов. Охладите 1,5-миллилитровые конические пробирки, не содержащие РНКазы, ступку, пестик и шпатель в жидком азоте в соответствии с текстовым протоколом. Поместите образец жировой ткани в ступку, затем с помощью нескольких слоев коричневой бумаги вытащите пестик из жидкого азота и поместите его в ступку.

Держа пестик вместе с бумагой, ударьте молотком по верхней части пестика один или два раза. Далее измельчают образец с помощью вращательных движений до получения мелкого порошка. Затем извлеките пестик, извлеките шпатель из жидкого азота и с его помощью перенесите образец в соответствующую предварительно охлажденную коническую пробирку объемом 1,5 миллилитра.

Время от времени опускайте шпатель обратно в жидкий азот, чтобы предотвратить плавление образца. Кроме того, держите коническую трубку на сухом льду, чтобы предотвратить оттаивание образца. Заполните коническую пробирку примерно на 2/3 измельченным образцом для получения достаточного выхода РНК.

Затем подготовьте остальные образцы в соответствии с текстовым протоколом. Под химический капюшон и в лабораторном халате, перчатках и защитных очках извлеките измельченный образец из жидкого азота. Медленно откройте тюбик, и добавьте 500 микролитров раствора фенола.

Закройте крышку трубки и заведите вихрь на максимальной скорости примерно на пять секунд, затем медленно и осторожно откройте трубку, чтобы сбросить давление азота. Будет слышен звук воздуха, выходящего из трубки. Нанесите пипеткой в пробирку дополнительно 500 микролитров раствора фенола.

Затем сделайте вихрь и медленно откройте его, как и раньше. Сделайте образец вихревым до полного растворения. Затем откройте пробирку, чтобы сбросить давление перед обработкой дополнительных образцов.

После того, как все образцы будут обработаны, кратковременно окуните их в вихрь на максимальной скорости и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. Центрифугируйте пробирки при температуре 12 000 раз G и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Затем доведите трубки до комнатной температуры.

Чтобы избежать загрязнения, для каждого образца используйте пипетку P1000 с отфильтрованным наконечником, чтобы выделить как можно больше РНК из среднего розового слоя, проколов липидную фазу рядом с боковой стороной пробирки. Диспонируйте РНК в новые конические пробирки, не касаясь боковых сторон пробирок, чтобы предотвратить перенос липидов, присутствующих на внешней стороне наконечника. Добавьте в каждый образец по 200 микролитров чистого хлороформа и перемешайте пробирки методом инверсии в течение 15 секунд.

Затем, после инкубации образцов при комнатной температуре в течение 10 минут, центрифугируйте пробирки при температуре 12 000 G и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут и верните пробирки обратно к комнатной температуре. Для каждого образца используйте пипетку P1000 и отфильтрованные наконечники, чтобы перенести как можно больше водной прозрачной РНК-содержащей верхней фазы во второй набор соответствующих конических пробирок. Далее добавьте 500 микролитров 100% изопропанола в каждый образец и перемешайте пробирки путем инверсии в течение 15 секунд.

Затем инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 минут. Центрифугируйте пробирки при температуре 12 000 раз G и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут, прежде чем довести пробирки до комнатной температуры. Выбросьте изопропанол, вылив его из каждой пробирки.

Теперь добавьте один миллилитр 75% этанола в каждый образец и кратковременно перебейте пробирки на максимальной скорости. Затем центрифугируйте образцы при температуре 7 500 раз G и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. После вращения образцов и доведения их до комнатной температуры выбросьте 75% этанол, перевернув каждую трубку и зажигая, постукивая ими по коричневой бумаге, чтобы удалить остатки этанола.

Оставьте крышку открытой и высушите гранулу РНК на воздухе в течение примерно 15-20 минут. Оценив размер гранул РНК, добавьте от 10 до 25 микролитров воды, не содержащей РНКазы, в каждый образец. Инкубируйте образцы в тепловом блоке при температуре 60 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Затем кратковременно закрутите трубки. Инкубируйте образцы в том же тепловом блоке еще пять минут. Затем быстро закрутите все образцы и сразу же положите их на лед.

Провести ОТ-ПЦР для экспрессии генов в жировой ткани согласно текстовому протоколу. Как и ожидалось, мыши на диете с высоким содержанием жиров имели увеличенную массу тела и прибавку в весе по сравнению с однопометниками на обычной диете. Эти наблюдения сопровождались более чем двукратным увеличением массы PGF, PRF и SCF у мышей с ожирением по сравнению с мышами, находившимися на обычной диете.

Эта таблица показывает, что для каждой белой жировой ткани выделение РНК раствором фенола привело к образованию образцов с OD260 над OD280 около 2,0, что считается чистым для РНК. Как видно на этой гистограмме, данные ПЦР в реальном времени показали, что экспрессия мРНК лептина была значительно выше у мышей с ожирением PGF, PRF и SCF по сравнению с теми, кто придерживался обычной диеты. Наблюдаемые различия в экспрессии мРНК лептина не были связаны с вариацией s16, референсного гена, используемого для нормализации результатов между двумя группами мышей, поскольку значения КТ не были изменены.

После освоения этой техники ее можно выполнить за четыре часа, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что во время процедуры экстракции РНК необходимо работать в среде, свободной от РНКазы. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как амплификация ПЦР в реальном времени, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как модификации экспрессии генов.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области метаболизма к изучению модуляций жировой ткани, связанных с ожирением и диабетом у грызунов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как изолировать различные жировые пакеты и выделить из них РНК. Не забывайте, что работа с раствором фенола может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение лабораторного халата и перчаток.