С высоким разрешением Respirometry для измерения митохондриальной функции нетронутыми бета-клеток в присутствии природных соединений

Цель настоящего Протокола заключается в измерить влияние глюкозы опосредованной изменений митохондриального дыхания, в присутствии природных соединений на нетронутыми 832/13 бета-клеток с высоким разрешением respirometry.

Общая цель этого подхода заключается в непосредственной оценке дыхательной функции бета-клеток поджелудочной железы в условиях, стимулирующих инсулин. Это также может быть использовано для наблюдения за влиянием различных соединений на дыхательную функцию бета-клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области физиологии бета-клеток поджелудочной железы, например, влияет ли определенное соединение на функцию бета-клеток поджелудочной железы через изменения дыхания.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она может быть использована для непосредственной оценки дыхательной функции в бета-клетках поджелудочной железы в базальных и инсулиностимулирующих условиях. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы подготовки клеток и использования машины сложны для изучения из-за требуемой точности подготовки клеток и измерения дыхания. Для начала культивируйте бета-клетки, полученные из INS-1, в дополненном RPMI 1640.

Извлеките клетки из колбы T75, добавив два миллилитра 0,25% трипсина, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. Затем нейтрализуйте трипсин, добавив восемь миллилитров полной среды RPMI 1640. Разведите 100 микролитров клеточного объема в 900 микролитрах PBS, и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.

Затем поместите клетки с плотностью один миллион клеток на миллилитр в 10-сантиметровую чашку. Культивируйте клетки во влажном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2, прежде чем начинать эксперименты по дыханию. Смените среду через 24 часа после нанесения покрытия и культивирования клеток 832/13 в увлажненном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2.

Затем обработайте клетки контрольным носителем или производным какао, эпикатехиновым мономером, до конечной концентрации 100 наномоляров. После добавления обработки посевом в течение дополнительных 24 часов в увлажненном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2. Затем промойте клетки в 1x буфере для анализа с низким содержанием глюкозы или SAB в течение пяти минут.

Аспирируйте буфер и инкубируйте клетки в 1x низкоглюкозном SAB в течение трех часов, меняя буфер каждый час. После инкубации удалите клетки из чашки с одним миллилитром 0,25% трипсина. Соедините клетки трипсина из чашки, обработанной с помощью средства контроля, с четырьмя миллилитрами SAB в 15-миллилитровой конической пробирке.

Аналогичным образом соедините блюдо, обработанное интересующим составом, с буфером. Разведите 100 микролитров клеточного объема в 900 микролитрах PBS, и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Разведите 100 микролитров клеточного объема в 900 микролитрах PBS, и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.

Данные показывают, что наиболее эффективной является концентрация в один миллион клеток на миллилитр. После подготовки респирометра с высоким разрешением, как указано в текстовом протоколе, добавьте 2,4 миллилитра 1x буфера SAB с низким содержанием глюкозы в каждую камеру оксиграфа. Непрерывно перемешивайте буфер с помощью магнитных перемешивающих стержней в камере при 750 об/мин и 37 градусах Цельсия, с интервалом записи данных 2,0 секунды.

Для этого нажмите кнопку F7 и откройте вкладку с надписью «системы». Вставьте поршни до упора, а затем втяните их в положение аэрации гаечного ключа. Дайте машине уравновеситься в течение как минимум одного часа, пока не будет получен стабильный поток кислорода.

Затем установите Машину на 37 градусов Цельсия на время эксперимента. Нажмите кнопку F7 и откройте вкладку с надписью Oxygen O2, чтобы установить напряжение поляризации на 800 милливольт с коэффициентом усиления два. Уравновешивайте концентрацию кислорода в буфере SAB в течение не менее 30 минут, пока изменение концентрации кислорода не станет стабильным.

Затем выберите область, где изменение концентрации кислорода стабильно, чтобы установить фоновое измерение изменения концентрации кислорода, нажав клавишу Shift, щелкнув левой кнопкой мыши и проведя мышью по выбранной области. Нажмите на букву, связанную с выбранной областью, и измените ее на R1 для каждой трассы, соответствующей каждой из двух камер. Дважды щелкните по полку калибровки O2 в левом и правом нижнем углах экрана.

Нажмите кнопку «Выбрать метку» для калибровки воздуха как R1, а затем выберите «Калибровать и скопировать в буфер обмена» для обеих камер. Затем загрузите по 2,4 миллилитров образца в каждую камеру, загрузив одну камеру с клетками, обработанными контрольным транспортным средством, и одну камеру с обработанными компаундами клетками с 1x низким содержанием глюкозы SAB. Нажмите на поршень до упора и втяните остаточный объем.

Непрерывно перемешивайте клетки на протяжении всего эксперимента при 750 об/мин и 37 градусах Цельсия для всех последующих этапов. Сделайте отметку, нажав клавишу F4 и пометив ее как ячейки при загрузке образцов. Измеряйте образцы в течение 30 минут.

После стабилизации сигнала выберите область изменения концентрации кислорода, соответствующую условиям низкого уровня глюкозы. Затем добавьте 12,5 микролитров 45% стерильного раствора глюкозы в каждую камеру через титановый загрузочный порт с помощью шприца. Сделайте отметку с маркировкой глюкозы, когда будет добавлено лечение.

Дайте сигналу стабилизироваться и зарегистрируйте клеточное дыхание до тех пор, пока не будет достигнут стабильный поток кислорода. На этом этапе выберите область изменения концентрации кислорода, которая будет представлять показания глюкозы в 16,7 миллимоляра, что соответствует стимулирующим условиям. После того, как будет достигнута стабилизация сигнала, добавьте по одному микролитру пятимиллимолярного олигомицина А в каждую камеру через загрузочное отверстие.

Сделайте отметку с надписью «OligoA» при добавлении средства. Дайте сигналу стабилизироваться и зарегистрируйте клеточное дыхание до тех пор, пока не будет достигнут стабильный поток кислорода. Как только будет достигнут стабильный поток кислорода, выберите эту область кривой.

Олигомицин А ингибирует АТФ-синтазу, и, таким образом, единственный поток кислорода происходит через утечку электронов, а не через окислительное фосфорилирование. Затем добавьте один миллимолярный FCCP с шагом в один микролитр до тех пор, пока не будет установлена максимальная скорость дыхания. Это представляет собой максимальное несвязанное дыхание.

От трех до четырех микролитров FCCP достаточно для того, чтобы индуцировать максимальное несвязанное дыхание бета-клеток 832/13, полученных из INS-1. Сделайте отметку с надписью FCCP при добавлении лечения. Дайте сигналу стабилизироваться и зарегистрируйте клеточное дыхание до тех пор, пока не будет достигнут стабильный поток кислорода.

Затем выделите эту область кривой. FCCP является разобщающим агентом, позволяющим измерять несвязанное дыхание. После того, как будет достигнута стабилизация сигнала, добавьте по одному микролитру пяти миллимолярных антимицина А в каждую камеру через загрузочный порт.

Сделайте отметку с надписью AntiA при добавлении лечения и повторите процедуру выбора кривой. Введите количество клеток на миллилитр, использованное в анализе, нажав кнопку F3 программы анализа респирометра. Измените единицы измерения на клетки на миллилитр, введите клеточную концентрацию и измените среду на SAB.

Выберите фоновые показания для нормализации данных путем выбора и ввода в форму калибровки кислорода. Сделайте выбор показаний 2,5 миллимолярной глюкозы, 16,7 миллимолярной глюкозы, олигомицина А, FCCP и антимицина А. В программе анализа респирометра введите концентрацию белка и выберите соответствующие средние значения для каждой обработки во время измерения дыхания. Затем нажмите F2 и выберите функцию копирования в буфер обмена.

При этом данные экспортируются для использования в других программах анализа. Для расчетов используйте отрицательные значения уклона O2. Соберите данные для трех-пяти независимых прогонов контрольных клеток, обработанных носителями, и клеток, обработанных природными соединениями, чтобы определить влияние на интактное клеточное дыхание бета-клеток 832/13, полученных из INS-1.

Интактные бета-клетки 832/13, полученные из INS-1, демонстрируют индуцированное глюкозой увеличение утилизации кислорода. Очень важно, чтобы использовалось соответствующее количество ячеек. Результаты, собранные в этом эксперименте, показывают, что один миллион клеток на миллилитр является оптимальным количеством.

Бета-клетки 832/13, полученные из INS-1, обработанные куркумином, не демонстрируют изменений в общем дыхании. И наоборот, бета-клетки 832/13, полученные из INS-1, обработанные мономерными какао-эпикатехинами, имели усиленное дыхание при 2,5 миллимолярной глюкозе и 16,7 миллимолярной глюкозе. Усиленное дыхание также наблюдается во время состояния утечки, которое является базальным, нефосфорилирующим респираторным состоянием, а также дыхания электронно-транспортной системы или состояния ETS, которое является максимальным дыханием.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как непосредственно оценить дыхательную функцию бета-клеток поджелудочной железы в условиях стимуляции инсулином. После освоения этой техники ее можно выполнить за пять часов, если она выполнена правильно. Пытаясь использовать эту процедуру, важно помнить о предварительной обработке клеток буфером с низким содержанием глюкозы SAB и получить точный подсчет клеток для анализа.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности с получением нужного количества клеток для эффективных измерений. При слишком большом количестве ячеек сигнал трудно оценить, а при слишком малом их количестве сигнал недостаточно высок для последовательного измерения. Применение этого метода распространяется на терапию или диагностику диабета и любого состояния, на которое влияют изменения в функции бета-клеток поджелудочной железы, потому что митохондриальное дыхание является критически важным компонентом секреции инсулина.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как глюкозостимулированная секреция инсулина, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, каково влияние этих соединений на секрецию инсулина? Хотя этот метод может дать представление о функции бета-клеток, он также может быть применен к другим системам, таким как мышечные, печеночные, жировые и другие митохондриальные дыхательные анализы.