Обнаружение моющих средств чувствительных взаимодействия между мембранные белки

Общая цель этой процедуры — обнаружить чувствительные к детергенту взаимодействия между мембранными белками или другими белками. Эта процедура требует, чтобы один белок был помечен гистидином и чрезмерно экспрессировался в клетках, в то время как другой является пептидом, меченным myc. Этот метод может помочь ответить на важные вопросы в области биохимии исследования взаимодействия белков.

Основным преимуществом этой методики является способность обнаруживать взаимодействие между мембранными белками чувствительным к моющим средствам способом. Процедура быстрая и простая. Хотя этот метод может дать представление о мембранных белковых взаимодействиях, он также может быть использован для изучения слабых белковых взаимодействий.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы хотели проверить взаимодействие между мембранными белками, салтилином и GLUT4, но попытки их ко-иммунопреципитации из лизиса млекопитающих не увенчались успехом. Чтобы разместить заказ на пептид, выберите целевую последовательность пептида, критичную для взаимодействия, и добавьте эпитоп myc в конце или на С-конце последовательности. Как только пептид поступит, пепарируйте 100 микрограммов на миллилитр рабочего раствора пептида в ультрачистой воде.

Посадите три преадипоцитарные клетки 3T3-L1 в четыре 10-сантиметровые чашки для культивирования и храните в инкубаторе. Затем трансфицируйте две чашки для культивирования целевого белка, помеченного 6X годином, и пометьте как HISP в двух других чашках двумя контрольными плазмидами и пометьте как WT. После трансфекции оставьте клетки в инкубаторе на 48 часов до достижения конфлюенции от 80 до 90%. Чтобы приготовить лизат клеток, промойте клетки на льду три раза 10 миллилитрами 1Х буферизованного физиологического раствора, охлажденного четырьмя градусами Цельсия.

Затем добавьте в каждый из них по 500 микролитров буфера для лизиса. Затем отделите клетки от посуды с помощью скребка для клеток, чтобы приготовить лизат. Переложите приготовленный из каждой чашки для культивирования клеточный лизат в четыре отдельные 1,5-миллиметровые пробирки и промаркируйте все пробирки.

Затем пропустите лизат клеток через шприц иглой 26 калибра вверх и вниз пять раз для полного лизиса клеток. Затем центрифугируйте клеточные лизаты при 16000xg в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите надосадочную жидкость в четыре новые пробирки с одинаковой маркировкой.

Для будущих экспериментов по устранению неполадок и контролю добавьте 20 микролитров клеточного лизата и храните его при температуре 20 градусов Цельсия. Для последующего использования титруйте промывочный буфер при PH8 соляной кислотой, чтобы получить PH6, и храните буфер при четырех градусах Цельсия. Далее, чтобы приготовить однородную суспензию из кобальтовых шариков, тщательно взболтайте бутылку.

Затем перелейте 40 микролитров суспензии кобальтовых шариков во все индивидуально обозначенные четыре пробирки. После добавления кобальтовых шариков добавьте в пробирки один миллилитр буфера для лизиса. Затем центрифугируйте пробирки при 1000xg в течение пяти секунд.

Выбросьте надосадочную жидкость и пипеткой 40 микролитров буфера для лизиса в осевшие шарики. Затем перенесите лизат клеток в соответствующие пробирки и инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 90 минут на вращателе трубок. Через 90 минут центрифугируйте образцы при 1000xg в течение пяти секунд.

Затем соберите надосадочную жидкость с маркировкой Flowthrough-1 и храните при температуре 20 градусов Цельсия. Затем добавьте 500 микролитров промывочного буфера с PH8 в отдельные пробирки и осторожно снова суспензируйте шарики. Центрифугируйте пробирки при 1000xg в течение пяти секунд и удалите надосадочную жидкость.

Затем добавьте в пробирки промывочный буфер с PH8 с или шестью пробирками, в соответствии с этикетками и хорошо суспендируйте шарики. Центрифугируйте пробирки при 1000xg в течение пяти секунд и удалите надосадочную жидкость. Приготовьте один микрограмм на миллилитр рабочего раствора пептида и воды буфера с PH6 или восьми.

Затем добавьте 100 микролитров раствора пептида в промытые шарики, соответствующие аналогичному PH. Затем инкубируйте бусины при температуре четыре градуса Цельсия на вращателе трубок в течение 30 минут. Затем возьмите четыре микроколонки, промаркируйте их и поместите колонки в сборные пробирки с маркировкой Flowthrough-2. После того как инкубация закончится, добавьте инкубационную смесь в колонки.

Пропустите раствор под действием силы тяжести и соберите образец из потока. Поместите колонки в новые тубы для сбора и храните при температуре 20 градусов Цельсия. Затем пропустите 500 микролитров промывочного буфера с PH6 или восемью гравитационным потоком через отдельные колонки и выбросьте проточный.

Повторите этот шаг четыре раза. Центрифугируйте пробирки при 1000xg в течение пяти секунд. Поместите колонку в новую пробирку для сбора с надписью Elution.

Важно промывать шарики во всех тюбиках очень тщательно и одинаково, чтобы избавиться от несвязанного пептида. К промытым шарикам добавьте 40 микролитров трицинового образца буфера с бета-меркаптоэтанолом. Дайте постоять 20 минут при комнатной температуре.

Центрифугируйте колонку при 8000xg в течение двух минут. Выбросьте колонны и нагрейте сборные трубки при температуре 100 градусов Цельсия в течение 10 минут. А затем центрифугируйте его при 1000xg в течение пяти секунд.

В качестве альтернативы добавьте 40 микролитров буфера Elution Imidazole в промытые бусины и выдерживайте при комнатной температуре в течение 20 минут. После окончания инкубации центрифугируйте пробирки при температуре 8000xg в течение двух минут. Выбросьте колонки и добавьте 40 микролитров образца трицина.

Нагрейте сборные трубки при температуре 100 градусов Цельсия в течение 10 минут, а затем центрифугируйте при температуре 1000xg в течение пяти секунд. Используйте имеющиеся в продаже 10-20% трицин градиентные гели. Используйте буфер для работы Tris/Tricine/SDS, затем загрузите по 20 микролитров в каждый из элюированных образцов и общих лизатов на гель и запустите блок электрофореза.

После завершения электрофореза используйте буфер для переноса с добавлением 20% метанола для переноса материала из геля на мембрану из нитроцеллюлозы толщиной 0,45 микрометра. После блокировки мембраны разрежьте ее горизонтально. Затем прозондируйте верхнюю часть мембраны антителом Anti His P в нижней половине мембраны с помощью анти myc.

Для изучения взаимодействия иммобилизованного сортилина с кобальтовыми гранулами в GLUT4 был проведен иммуноблот-анализ. Клеточные лизаты и элюаты были получены диким типом и трансфицированными клетками 3T3-L1, меченными Sortilin-myc/His, а затем загружены на страницу SDS. Блоттинг зондировали анти-myc антителами.

На блоттинге показан 110-килодотинистый Sortili-myc/His-меченый и пятикилотин myc-первая люминальная петля-GLUT4 из трансфицированных элуатов. Далее, для изучения важности PH и взаимодействия между сортилином, иммобилизованным на кобальтовых гранулах, и GLUT4, был проведен иммуноблот-анализ. В этом анализе Myc-первую люминальную петлю GLUT4 инкубировали с гранулами, иммобилизованными белками Sorttilin-myc/His-мечеными как при PH6, так и при 8

Блот показывает четкое взаимодействие между Sortilin-myc/His и myc-первой люминальной петлей GLUT4 как в PH6, так и в восьми из элюатов, полученных из трансфицированных клеток 3T3-L1, меченных Sortilin-myc/His. После освоения этой техники ее можно сделать за три-четыре часа, пока образцы не будут готовы для анализа западной крови. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о разработке пептида, который растворим, предпочтительно в воде.

Чтобы укрепить результаты, можно использовать другие методы, такие как иммунопреципитация после кросслинкинга. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как обнаружить мембранный белок, белковые взаимодействия при процедуре, чувствительной к моющему средству. Это также позволяет исследовать взаимодействие между фрагментами белка.

Мягкий ритмичный джаз.