Визуализация ДНК уплотнения в цианобактерий, томография высокого напряжения крио электрон

Этот протокол описывает, как визуализировать переходных уплотнения ДНК в синезеленых водорослей. Синхронные культивирования, мониторинг микроскопии флуоресцирования, быстрое замораживание и высокого напряжения крио электронная томография используются. Представил протокол для этих методик, и будущие приложения и события обсуждаются.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микробиологии, например, как меняется структура ДНК в течение клеточного цикла бактерий. Основное преимущество этой методики заключается в том, что можно визуализировать ультраструктуру целых бактериальных клеток, близкую к жизненному состоянию, в соответствующие моменты времени без каких-либо дополнительных обработок. Демонстрировать процедуру будут Чихонг Сонг, постдок из моей лаборатории, и Мако Хаяши, аспирант из лаборатории доктора Канеко.

Начните с выращивания цианобактерий на девятисантиметровых стерилизованных пластинах BG-11, содержащих 1,5% агара и 0,3% тиосульфата натрия. Инкубируйте планшеты при температуре 23 градуса Цельсия при 12-12 световом цикле с 50 микро-Е светом на квадратный метр в секунду. Чтобы сохранить клетки, еженедельно перекладывайте их на свежие агаровые пластины BG-11.

В течение одной недели культуры появляются в виде зеленых полос. Перенесите зеленые скопления клеток с помощью стерилизованной пламенем петли и нанесите их на новую пластину. Чтобы наблюдать за уплотнением ДНК, соберите клетки, культивируемые в течение шести дней в конце светового периода.

Чтобы освободить клетки от пластины, добавьте один миллилитр 0,2-молярной сахарозы. Затем соберите клеточную суспензию и повторяйте добавление и удаление сахарозы до тех пор, пока раствор не станет зеленым. Изменение цвета указывает на то, что большая часть клеток была высвобождена.

Теперь перенесите 500 микролитров раствора взвешенных клеток в пробирку Microfuge и добавьте краситель Hoechst для конечной концентрации один микрограмм на миллилитр. Затем дайте клеткам инкубироваться в темноте в течение 10 минут. Далее раскрутите клетки, выбросьте надосадочную жидкость и снова суспендируйте их в 10 микролитрах 0,2-молярной сахарозы.

Далее переложите один микролитр суспензии на предметное стекло, наденьте покровную крышку и понаблюдайте за клетками под флуоресцентным микроскопом, оснащенным УФ-фильтром. Используя объектив для 100-кратного погружения в масло, ищите признаки уплотнения ДНК, которое должно наблюдаться в большинстве клеток. Для начала подготовьте устройство для погружной заморозки.

Затем установите контейнер с жидким азотом, вставив в него контейнер с этаном и насадку для охлаждающего стержня. Далее заполните емкость жидким азотом, и охладите ее до температуры жидкого азота. После этого загрузите в емкость газообразный этан.

Обязательно надевайте защитные очки, так как жидкий этан взрывоопасен. Наконец, снимите крепление для охлаждающего стержня и накройте контейнер пластиковой крышкой, чтобы избежать прикрепления инея. Чтобы продолжить, разряжайте углеродную сторону электромагнитной сетки с углеродным покрытием в течение 30 секунд при давлении 50 миллиампер с помощью плазменного ионного барьера.

Затем приготовьте Vitrobot в соответствии с протоколом испытаний. С помощью пинцета установите предварительно обработанную ЭМ сетку в камеру. Перед нанесением образца обработайте ЭМ-сетку одним микролитровым 15-нанометровым индикатором золота BSA, который будет служить реперным маркером.

Теперь нанесите 2,5 микролитра клеточной суспензии на сетку. Промокните излишки раствора с помощью фильтровальной бумаги, и сразу же заморозьте сетку в жидком этане. Храните замороженные решетки в жидком азоте до тех пор, пока их можно будет исследовать.

Затем запустите HVEM и установите его на высокое напряжение в один мегавольт. Затем охладите держатель сетки образца до минус 150 градусов Цельсия с помощью жидкого азота. После охлаждения установите замороженную решетку в охлаждаемый держатель криообразца и загрузите ее в HVEM.

Будьте осторожны, чтобы не загрязнить установку льдом. Теперь выберите область изображения с малым увеличением в 1000 раз. Затем отрегулируйте высоту эуцентрической оси Z и наклоните предметный столик на отрицательные 60 градусов.

Затем устраните люфт наклонного вращения. Теперь сфокусируйтесь вблизи целевого места с увеличением в 10 000 раз. Установите нижний фокус от шести до 10 микрон за счет отклонения от сфокусированного изображения.

Для визуализации установите дозу равной двум электронам на квадратный ангстрем в секунду или меньше. Следите за дозой электронов, которая отражается плотностью тока, и сделайте снимок с помощью цифровой камеры или на электронной пленке. Затем соберите изображения наклона от отрицательных 60 до положительных 60 градусов с шагом от двух до четырех градусов.

По возможности используйте автоматизированные функции микроскопа. Откройте коммерческое программное обеспечение и загрузите изображения наклона для томографической реконструкции. Затем создайте файл стека изображений из отдельных изображений с помощью команды tif2mrc или newstack.

Затем запустите программное обеспечение eTomo GUI и введите параметры изображения для размера в пикселях, реперного диаметра, поворота изображения и так далее. Таким образом, создаем сценарий редактирования. Теперь с помощью предложенного программного обеспечения можно создать ряд наклонов, выровненный с помощью реперных маркеров, со средней статической погрешностью менее 0,5.

Наконец, реконструируйте 3D-томограмму с помощью алгоритма SIRT. Теперь извлеките из томограммы интересующую вас область и примените фильтр шумоподавления, такой как анизотропный диффузионный фильтр, двусторонний фильтр или математический морфологический фильтр. Выполните фильтрацию с использованием параметров, повышающих контрастность изображения.

Затем сегментируйте интересующий вас объект. Используйте функцию среза, чтобы открыть томограмму. Затем перейдите в окно Редактор сегментации и выберите новое поле метки, чтобы создать файл сегментации.

Затем вручную обведите границу интересующего признака в первом срезе, а затем в каждом из остальных срезов. С помощью тех же операций можно добавить интересующую вас функцию. Теперь, чтобы создать визуализацию поверхности с помощью опций в меню SurfaceGen для визуализации сегментированного объема, выберите меню SurfaceView.

Чтобы перемещать, вращать и масштабировать 3D-объем, используйте инструменты в окне 3D-просмотрщика. Автоматическая сегментация может быть выполнена с помощью инструмента «Волшебная палочка». Нажмите на объект и отрегулируйте ползунки в меню «Отображение» и «Маскирование» таким образом, чтобы функции объекта были полностью выбраны.

В точной синхронной культуре ДНК, меченная Хёхстом, показывает нормальное равномерное распределение в темных условиях, а затем постепенно уплотняется внутри клетки в течение светового периода, приобретая волнистую палочковидную структуру к концу светового периода. Наконец, палочка делится в центре, и две его части распределяются по дочерним клеткам. После деления клетки уплотненная ДНК немедленно исчезает, и ДНК возвращается к нормальному равномерному распределению.

Когда клетки на последней стадии уплотнения ДНК были заморожены и наблюдались с помощью высоковольтной электронной микроскопии, многие из них показали отчетливое уплотнение ДНК, которое было легко отличить от нормальных клеток. У некоторых наблюдалось сужение в центре клеток, как и ожидалось перед делением клеток. Из 3D-томограмм компактная ДНК визуально отделяется в цитоплазме и окружена материалом с низкой плотностью.

Слои тилакоидной мембраны деформированы вдоль волнистого стержня уплотненной ДНК. Интересно, что многие мелкие фосфатные тельца прилипают к уплотненной ДНК и обычно появляются парами. Эти полифосфатные тела могут быть поставщиками фосфатов для синтеза ДНК.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как визуализировать ультраструктуру целых бактериальных клеток, близкую к живому состоянию в соответствующий момент времени, с помощью крио-высоковольтной электронной микроскопии без какой-либо дополнительной обработки, такой как окрашивание. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что состояние уплотнения ДНК меняется с каждой минутой в конце светового цикла. Убедитесь, что вы не пропустите лучшее время для замораживания образца.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как CLEM, чтобы ответить на дополнительные вопросы о локализации специфических белков или нуклеотидов в уплотненной ДНК. После своего развития этот метод должен проложить путь исследователям в области микробиологии к изучению деления клеток, сегрегации ДНК и вирусной инфекции у бактерий или у мелких эукариот.