Визуализация АТФ-синтазы димеров в митохондриях с помощью электронной Cryo-томографии

Общая цель этой процедуры заключается в определении структуры и организации митохондриальных белков в С-2. Это достигается путем создания замороженной сетки гидратированного электронного микроскопа, содержащей образец. Затем в электронный криомикроскоп записывается ряд наклона образца с ограниченной дозой.

Затем ряд наклонов обрабатывается для создания томографического объема. Наконец, плотность белков усредняется для определения структуры белков, а мембраны сегментируются для выявления их трехмерной структуры. Путем повторного позиционирования средних значений белков обратно в метод Тома Грэхема выявляется структура и организация белков в мембране.

Поэтому мы делаем электронную томографию митохондрий, потому что хотим понять, как они работают на молекулярном уровне. Основное преимущество этой методики перед другими методами, такими как электронная микроскопия тонких пластиковых срезов, заключается в том, что разрешение выше. Материал никак химически не фиксируется, а молекулярные детали белков сохраняются.

Освоение техники электронной криптографии может занять некоторое время, но опытные пользователи могут приобрести пять-шесть высококачественных грунтов TOM за сеанс. Наиболее сложной частью процедуры является получение замороженных гидратированных сеток оптимальной толщины льда После выделения и гранулирования митохондрий, согласно текстовому протоколу, используйте 250 миллимолярных триозов Т в 10 миллимолярном буфере HEPA для повторного суспендирования гранулы до концентрации примерно пять миллиграммов на миллилитр общего тлеющего разряда белка. Полностью углеродные электромагнитные решетки угольной стороной вверх в вакуумном устройстве в соответствии с инструкциями производителя разжижают несколько миллилитров этана, направляя поток этана на внутреннюю сторону алюминиевого контейнера, охлаждаемого жидким азотом.

С помощью пинцета возьмите в руки сетку тлеющего разряда DM и поместите ее на скамью смешайте белок, сопряженную золотую реперную суспензию, один к одному с митохондриальной суспензией, и сразу же нанесите три микролитра раствора на сетку. Далее поместите пинцет в устройство для остекловывания, например, самодельную гильотину с клином фильтровальной бумаги, промокните лишнюю жидкость от сетки и отпустите спусковой крючок, чтобы немедленно погрузить сетку в жидкий этан. Затем перевести сетку с жидкого этана на жидкий азот.

Удалите излишки этана из сетки, поместив кончик свежей фильтровальной бумаги в жидкий этан. Когда жидкость поднимется, осторожно потяните сетку вверх по фильтровальной бумаге, держа ее ниже фронта жидкости, а затем немедленно переложите ее в жидкий азот для хранения для последующего использования. Поместите сетку в сетчатую коробку и храните в заполненном жидким азотом устройстве, чтобы записать серию томографических наклонов.

Начните с того, что убедитесь, что дозаторы жидкого азота заполнены, и убедитесь, что температура ступени образца и передаточного устройства сетки ниже 100 кельвинов. Убедитесь, что электронный микроскоп хорошо выровнен, получив изображение тестовой сетки и проверив качество колец шипов, которые должны быть круглыми и простираться до края изображения. Далее вставляем сетку с замороженными гидратированными митохондриями.

Затем в режиме поиска найдите участки с подходящей толщиной льда и качеством образца. Сделайте шестисекундное поисковое изображение перспективных участков, чтобы определить пригодность для сбора данных. После определения хорошей области для образца наклоните предметный столик плюс-минус 60 градусов, чтобы определить максимальный диапазон наклона, доступный без загораживания экспонирования или зоны фокусировки решеткой или кристаллами льда на ближайшей заполненной льдом лунке аналогичного вида, переключитесь в режим экспозиции и отрегулируйте интенсивность луча или время получения изображения.

Таким образом, каждое записанное изображение имеет дозу электронов от 30 до 50 электронов на пиксель для ПЗС-матриц или от шести до восьми электронов на пиксель в секунду. Для детекторов прямых электронов рассчитайте отношение распределения дозы или I ноль от I 60, разделив среднее количество электронов для односекундного изображения, полученного при нуле градусов, на изображение под углом 60 градусов над пустым отверстием. Получите изображение за одну секунду в режиме экспозиции и запишите количество электронов на квадрат ангстрема.

Принимая во внимание коэффициент распределения дозы, рассчитайте общее количество изображений и интервал наклона, которые могут быть зарегистрированы для конкретной общей дозы электронов с помощью соответствующего программного обеспечения для автоматического сбора данных. Настройте и запишите Том Аграм с только что определенными параметрами типичного томоса. Для этих образцов начните с плюс-минус 20 градусов и проходите через ноль градусов, прежде чем дойти до высоких наклонов.

Чтобы создать и сегментировать томо, преобразуйте ряд наклона в формат файла, подходящий для программного обеспечения для восстановления. Используя программу реконструкции Тома Грэхема, такую как Im mod, выровняйте изображения, отметив положение золотых реперных маркеров. После выравнивания создайте Томмо Грэхема.

Увеличьте контрастность томмо Грэхема с помощью фильтра изображения, такого как нелинейный изотропный диффузионный фильтр, распределенный с IM o для визуализации. Используйте имеющиеся в продаже программы для ручного сегментирования Тома. Назначьте вокселы, соответствующие внутренней и внешней мембране, отдельным слоям, после назначения создайте поверхность для визуализации мембран.

Используя опцию кликера в плагине пакета EM для emira, отметьте местоположение частиц синтазы TP, используя отмеченные частицы в качестве входных данных и соответствующий программный пакет, такой как оценка частиц. Для программы электронной томографии рассчитайте среднее значение аграммы для оценки разрешения. Рассчитайте корреляцию оболочки фойе между двумя независимо определенными субтоммо средними значениями с помощью бесплатной программы визуализации.

Химера подгоняет известные рентгеновские структуры в среднее значение Тома Аграма сначала вручную, а затем автоматически с помощью команды подгонки, как видно на этом рисунке, ручная сегментация мембран в митохондриальном электронном крике раскрывает структуру Christi в митохондриях. Визуализируя митохондрии из нокаутирующих штаммов дрожжей, в которых отсутствуют определенные белки. Можно оценить влияние этих белков на морфологию Кристи.

Здесь показана митохондрия из штамма дрожжей, лишенного субъединицы синтеза TP E, которая необходима для образования димеров синтеза TP. В отличие от обычных митохондрий дикого типа, эти органеллы содержат ряд внутренних мембранных структур, которые либо лишены Christi, либо содержат небольшие мембранные инвагинации в форме баллона. В инграммах с хорошим контрастом димеры A TP Synthes хорошо видны, как показано здесь желтыми стрелками.

Путем сегментации мембран расположение синтеза A TP, представленного в настоящее время желтой сферой, может быть визуализировано в связи с морфологией Christi. В этом случае синтез A TP образует ряды димеров вдоль сильно изогнутых краев усреднения Lo Meer Christi Sub tommo позволяет определять структуры белков с разрешением четыре нанометра или выше. Встраивая известные рентгеновские структуры в субтомо Грэхема, можно собрать усредненные атомные модели белковых комплексов в их естественной среде так, как они видны.

В этом примере средние объемы могут быть помещены обратно в систему Томо Грэхема, чтобы помочь организации отдельных комплексов относительно друг друга и других белковых комплексов в мембране. Наш протокол демонстрирует, как можно использовать электронную криотомографию для определения структуры и организации белковых комплексов во внутренней митохондриальной мембране. Этот протокол также может быть использован для определения структуры и организации других мембранных белков в различных клеточных компартментах.

Подготовка образцов является ключом к получению хороших термограмм. Замороженная гидратированная сетка должна содержать идеально стекловидные глазки толщиной от 70 до 150 нанометров. Обычно мы просеиваем пять-шесть сеток, пока не найдется область с оптимальной толщиной льда и качеством образца.

Для сбора грамма лучше всего подходит 300-киловольтный просвечивающий электронный микроскоп со специальным криостоликом и энергетическим фильтром, а также камера с прямым электронным детектором, но также можно использовать 200-киловольтный прибор с боковым входным криостоликом и ПЗС-камерой. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как правильно готовить сетку cry m. Соберите ряд наклонов, восстановите термограмму и рассчитайте среднее значение ниже томмо.

Это основные навыки, необходимые для исследования того, как организация белков в клетке влияет на способность клетки выполнять биологические функции, такие как эффективный синтез A TP. Не забывайте, что работа с жидким азотом и жидким Итаном может быть очень опасной, поэтому защитные очки и перчатки следует носить постоянно.