Простой метод для изоляции протопласта сои и приложения для анализа переходных ген выражение

Мы разработали простой и эффективный протокол для приготовления большого количества сои протопласта для изучения сложных механизмов регулирования и сигнализации в живых клетках.

Общая цель этого метода заключается в получении высококачественных протопластовых клеток из сои для изучения регуляторных и сигнальных механизмов в живых клетках сои. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в регулятивных сетях, такие как их непосредственный ген-мишень, фактор трансфузии открытия и какой у них партнер по взаимодействию, открыть белок. Главное преимущество этой техники – искусство.

Он производит большое количество однородных протопластовых клеток сои, и это просто и легко. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что очень трудно получить хорошие протопласты из листьев сои, если вы не объедините листья на определенной стадии. Выбор листьев на соответствующей стадии развития является ключом к успешной подготовке протопластов сои.

Срезайте только что разросшиеся однолистные листья с 10-дневной рассады сои. Чтобы убедиться, что при высоком выходе протопласта из образца соберите не менее трех образцов однолистных листьев на немного разных стадиях развития. Свежим лезвием бритвы удалите среднюю жилку с каждого однолистного листика, а затем нарежьте остатки на полоски от 0,5 до одного миллиметра.

С помощью пары щипцов аккуратно перенесите полоски листьев сразу в 10 миллилитров свежеприготовленного ферментного раствора в 15-миллилитровую трубку. Вакуумируйте полоски листьев в течение 15 минут при комнатной температуре. Инкубируйте полоски листьев в ферментном растворе при слабом перемешивании при слабом освещении в течение четырех-шести часов при комнатной температуре.

По мере высвобождения протопластов раствор фермента приобретает желто-зеленый цвет. Проверьте раствор фермента протопласта под микроскопом при 10-кратном увеличении, чтобы выбрать образец с наилучшим усвоением протопластов. Высвобождающиеся протопласты имеют сферическую форму, в то время как непереваренные клетки имеют неправильную или овальную форму.

Чтобы остановить пищеварение, аккуратно налейте 10 миллилитров раствора фермента протопласта с лучшим перевариванием протопластов в 50-миллилитровую пробирку и добавьте 10 миллилитров раствора W5 комнатной температуры. Осторожно переверните трубку несколько раз. Затем аккуратно налейте раствор фермента протопласта в чистую нейлоновую сетку толщиной 75 микрон, помещенную поверх трубки объемом 50 миллилитров, чтобы удалить непереваренные ткани листьев.

Затем центрифугируйте поток через раствор фермента протопласта в 100-кратном G в течение одной-двух минут при комнатной температуре. Затем с помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров аккуратно удалите надосадочную жидкость, не нарушая гранулу протопласта. Ресуспендируйте протопласт в охлажденном растворе W5, а 50-миллилитровую пробирку держите на льду.

После подсчета числа протопластов на гемоцитометре под микроскопом разведите до концентрации в два раза 10 до пятой части протопластов на миллилитр в охлажденном растворе W5. Подержите протопласт на льду в течение 30 минут. Центрифугируйте суспензию при 100-кратном перегрузке в течение одной-двух минут при комнатной температуре.

Затем с помощью пипетки объемом в один миллилитр аккуратно удалите раствор W5, не нарушая гранулу протопласта. Ресуспендировать протопласт в растворе ММГ при комнатной температуре в концентрации от двух до 10 до пятой части протопластов на миллилитр. Чтобы подготовить протопласт к трансформации, используйте неразрезанные наконечники пипеток объемом 200 микролитров, чтобы сделать 100 микролитров аликвот протопластов в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 миллилитра с низкой адгезией.

Отложите одну аликвоту, чтобы она служила в качестве отрицательного контроля. К оставшейся аликвоте протопластов добавьте 10 микролитров плазмидной ДНК. Медленно добавьте 110 микролитров свежеприготовленного раствора для колышков на внутреннюю стенку микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 миллилитров.

Затем аккуратно переверните и поворачивайте трубку до тех пор, пока раствор не станет однородным. Инкубируйте смеси для трансформации в течение 15 минут при комнатной температуре. Чтобы остановить трансформацию, медленно добавьте 400 микролитров раствора W5 в каждую 1,5-миллилитровую трубку комнатной температуры, и аккуратно переворачивайте трубку, пока раствор не станет однородным.

Центрифугируйте пробирки при 100-кратном перегрузке в течение одной-двух минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте по одному миллилитру раствора WI в каждую трубку.

Покройте поверхность лунки шестилуночной тканевой культуральной пластиной, чтобы предотвратить прилипание протопластов к пластине. Добавьте в каждую лунку по одному миллилитру пятипроцентной стерильной телячьей сыворотки, а через несколько секунд удалите телячью сыворотку с помощью пипетки. Перенесите ресуспендированные протопласты в лунки культуральной пластины, и накройте пластину крышкой.

Перед сбором урожая выдержите протопласты при комнатной температуре в течение двух суток в темноте. Через два дня перелейте раствор протопласта в микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитра с низкой адгезией. Центрифугируйте пробирки при 100-кратном перегрузке в течение одной-двух минут при комнатной температуре.

Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки. Перенесите 10 микролитров протопласта на предметное стекло. Наблюдайте флуоресцентные сигналы под флуоресцентной или конфокальной микроскопией с использованием нетрансформированных протопластов в качестве отрицательного контроля.

Клетки протопластов были получены из различных органов 10-дневной сои и изучены под микроскопом. Клеточные стенки гипокаудального и эпикаудального плохо переваривались. А некоторые клетки остались прикрепленными друг к другу.

В каудальном свинце и корне клеточные стенки были удалены только в небольшой части клеток. Напротив, большое количество протопластов наблюдалось при использовании унифолиата. Рассада на этом фото слева направо иллюстрирует однолистные листья, которые не раскрылись, только что раскрылись или полностью раскрылись.

В то время как как нераспущенные, так и только что разросшиеся однолистные листья приводили к высокому выходу протопластов, размер протопластов из только что расширенного унифолиата был более однородным, чем из нерасширенного унифолиата. Для полностью расширенной унифолиаты клеточные стенки в большинстве клеток все еще оставались неповрежденными. Тестирование различных количеств плазмидной ДНК показало, что большее количество ДНК приводит к более высокой эффективности трансформации.

Конфокальные изображения протопластов сои, преобразованных с конструкцией, экспрессирующей GFP, слитой с бобово-специфичным геном E1, показали ядерную локализацию гибридного белка E1 GFP, что согласуется с предыдущим исследованием с использованием системы протопластов Arabidopsis. Пытаясь использовать эту процедуру, важно помнить о необходимости эмпирической оптимизации каждого экспериментального условия, такого как выбор правильной стадии материала листа, продолжительность времени переваривания клеточной стенки, возраст концентрации и количество плазмидной ДНК для трансформации. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как репликация РНК и белков, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие гены или белки регулируются или не регулируются?

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как получить высококачественные клетки протопласта сои.