Количественные и качественные метод сфингомиелин, LC-MS, с использованием двух стабильных гетерогенны помечены виды сфингомиелин

Общая цель этой процедуры заключается в точном анализе количества и структуры каждого вида сфингомиелина в биологических образцах. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области липидов, относящиеся к биологии липидов и липидам Основное преимущество этого метода заключается в том, что мы можем охарактеризовать различные виды сфингомиелина в биологических образцах с помощью хроматографической масс-спектрометрической системы. Для начала извлеките питательную среду из 10-сантиметровой чашки для культуры тканей, содержащей клетки HeLa, и дважды промойте клетки шестью миллилитрами ледяного PBS.

Затем добавьте один миллилитр ледяного PBS в 10-сантиметровую чашку для культуры тканей и используйте скребок для сбора клеток. После удаления с поверхности чашки перенесите клетки в двухмиллилитровые силиконизированные пластиковые трубки. После центрифугирования удалите надосадочную жидкость и добавьте по одному миллилитру метанола в каждую гранулу клетки.

Затем кратковременно закрутите трубки. Затем поместите образцы в ультразвуковой аппарат банного типа и обрабатывайте ультразвуком при мощности 200 Вт в течение пяти минут. Когда закончите, переложите весь гомогенат клеток в пробирки, оснащенные винтовыми крышками с тефлоновой футеровкой.

Теперь добавьте в каждую пробирку один миллилитр метанола, один миллилитр хлороформа, 0,8 миллилитра дважды дистиллированной воды в 50 микролитров 10 микромолей внутреннего стандарта. Закройте трубки крышками и энергично закрутите их при скорости 2 500 об/мин в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем в каждую трубку добавьте дополнительно по одному миллилитру хлороформа и по одному миллилитру дважды дистиллированной воды.

Снова энергично перебейте трубки при 2 500 об/мин в течение пяти минут при комнатной температуре. Далее центрифугируйте образцы для того, чтобы полностью разделить водную и органическую фазы. Переложите нижнюю фазу в одноразовые стеклянные пробирки.

Добавьте в пробирки два миллилитра хлороформа. Затем энергично перебейте трубки при 2500 об/мин в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы достаточно смешать с верхней фазой и межфазным пухом. После второго центрифугирования перенесите модифицированную нижнюю фазу в одноразовые стеклянные пробирки вместе с начальной нижней фазой.

Теперь поместите стеклянные трубки под струю азота примерно на 60 минут и полностью удалите органические растворители в собранной нижней фазе. Наконец, восстановите образцы с помощью 500 микролитров метанола или этанола. Полученную смесь процедите с помощью фильтра 0,02 мкм в стеклянные флаконы.

Затем храните образец при температуре минус 20 градусов Цельсия. Выполняйте последовательные разведения стандартного состава и добавляйте по 50 микролитров каждой концентрации в отдельные пробирки. Затем подготовьте три образца для контроля качества, добавив к первому образцу количество, в пределах трех раз превышающее нижнюю границу стандартной кривой, количество вблизи центра кривой для второго образца и количество, близкое к верхней границе стандартной кривой, для третьего образца.

Затем добавьте гомогенат клеток в одном миллилитре метанола в каждую пробирку и извлеките общую липидную фракцию из каждого образца с помощью только что показанного метода. Для начала подготовьте мобильную фазу. Смешайте ацетонитрил, метанол и воду двойной дистилляции в соотношении два к одному для водной фазы.

Используйте изопропанол для органической фазы в стеклянных бутылках с завинчивающимися крышками, футерованными тефлоном. Затем обработайте обе подвижные фазы ультразвуком в течение пяти минут в ультразвуковом аппарате банного типа. Затем добавьте муравьиную кислоту до конечной концентрации 26,4 миллимоляра и гидроксид аммония в дозе 14,9 миллимоляра в каждую подвижную фазу.

Для качественного анализа активируйте высокоэффективную систему жидкостной хроматографии. Вставьте входные трубки в стеклянные бутылки, содержащие подвижные фазы, и продуйте линии ВЭЖХ. Затем подключите колонку ВЭЖХ C18 к системе ВЭЖХ.

Поддерживайте температуру в колонной печи на уровне 50 градусов Цельсия и кондиционируйте колонну с водной подвижной фазой со скоростью 100 микролитров в минуту. Во время прогона поместите образцы в штатив для образцов автоматического пробоотборника. Установите параметры тройной, четверной и четырехкратной линейной системы масс-спектрометрии с ионной ловушкой для трехступенчатого масс-спектрометрического анализа, как указано в таблице 1 и таблице 2 прилагаемого текстового протокола.

Кроме того, задайте параметры для первого и второго ионов-предшественников интересующих видов SM, как более подробно описано в сопроводительном текстовом протоколе. Создать батник и отправить батник для получения данных МС, трех продуктовых ионных спектров каждого вида сфингомиелина методом жидкостной хроматографии, электроспрея, ионизации, тандемного масс-спектрометрического анализа. Получение спектров ионов трехфазного продукта МС интересующих видов сфингомиелина с помощью жидкостной хроматографии, электроспрея, ионизации, тандемного масс-спектрометрического анализа.

Затем присвойте каждой МС три ионных спектра продукта сфингомиелина, сравнивая отношение массы к заряду ионных спектров продукта в точной массе длинноцепочечного основания сфингоида и интересующей n-ацильной части. Количественно проанализируйте сфингомиелин с помощью жидкостной хроматографии, электроспрея, ионизации, тандемного масс-спектрометрического анализа, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Затем обработайте данные мониторинга множественных реакций с помощью программного обеспечения для интеграции данных, чтобы получить данные пиковой площади для экстрагированной ионной хроматограммы каждого вида сфингомиелина.

Количественно оцените каждый вид сфингомиелина и постройте стандартные кривые, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Здесь показан спектр как химически синтезированного сфингомиелина, так и сфингомиелина в образцах липидов, экстрагированных из клеток HeLa. Следует отметить, что интенсивность спектра деметилированного сфингозилфосфорилхолина больше, чем у n-ацильной группы SM в обоих образцах.

Также представляет интерес спектр, соответствующий сфингозин-1-фосфату, полезен для предположения о количестве углерода и двойных связей сфингоидного длинноцепочечного основания сфингомиелина. В настоящем количественном методе крайне важно точно подготовить образцы для построения калибровочной кривой при валидации этого метода. Кривая, подгоняющая низкую концентрацию, была явно улучшена за счет использования весового коэффициента, равного одному на x в квадрате, по сравнению с весовым коэффициентом один или один на x.

Этот метод проложил путь исследователям в области биологии и промышленности к характеристике различных видов сфингомиелина в биологических образцах и промышленных продуктах, таких как косметика. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как точно анализировать количество и структуру каждого вида сфингомиелина в биологических образцах. Не забывайте, что работа с абсорбентами может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование надлежащих средств для ношения стекол.

Кроме того, важно надевать перчатки, чтобы предотвратить загрязнение липидами, полученными с рук.