Освещение пути к Caspase активации с помощью Bimolecular флуоресценции дополнения

Общая цель данной методики – визуализировать один из первых шагов в активации инициирующих каспаз. Этот этап называется индуцированной близостью и происходит, когда молекулы каспазы объединяются, образуя активные димеры во время апоптотической гибели клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области каспаз, такие как когда, где и насколько эффективно могут быть активированы конкретные инициирующие каспазы.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что можно визуализировать сборку комплексов активации каспаз в живых клетках в режиме реального времени. В этом методе комплементации биомолекулярной флуоресценции используются фрагменты белка тироксина Venus, которые инфузировались в каспазу. Фрагменты не флуоресцентны сами по себе, но когда каспазы подвергаются индуцированной близости, это объединяет две половины Венеры, и они загораются.

Для трансфекции клеток сначала добавьте 12 микролитров реагента для трансфекции к 750 микролитрам восстановленной сыворотки среды в стерильной пробирке. Выдерживайте смесь при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем добавьте 10 нанограммов репортерной плазмиды в стерильную 1,5-миллилитровую пробирку для каждой трансфицируемой лунки.

Добавьте по 20 нанограммов плазмы BiFC каждой каспазы в каждую пробирку. Доведите общий объем каждой тубы до 100 микролитров, добавив уменьшенное количество сыворотки. С помощью пипетки Р200 добавьте в плазмидную смесь по каплям 100 микролитров раствора трансфекционного реагента.

После инкубации плазмидной смеси реагентов для трансфекции в течение 20 минут при комнатной температуре, отсасывают среду из клеток с помощью пипетки или с помощью отсоса. Затем с помощью пипетки P1000 аккуратно смочите 800 микролитров бессывороточной среды вниз по стенке лунки. С помощью пипетки P200 добавьте по 200 микролитров липидного комплекса ДНК по каплям в каждую лунку.

Инкубируйте клетки в инкубаторе для культуры тканей при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов. После инкубации удалите бессывороточную среду, содержащую липидные комплексы ДНК, путем аспирации с помощью аспирации или с помощью пипетки, стараясь не нарушить монослой. Аккуратно внесите пипеткой два миллилитра предварительно подогретой питательной среды по стенке каждой лунки перед инкубацией клеток, как описано в текстовом протоколе.

Перед сбором данных выполните индукцию активации каспазы, как описано в текстовом протоколе. Включите микроскоп, следуя инструкциям производителя, и запустите программное обеспечение для сбора данных. Выберите масляный объектив 60x или 63x и капните каплю масла на объектив.

Затем поместите чашку для культивирования на предметный столик для микроскопа с помощью подходящего держателя для планшетов. Включите обогреватель и установите температуру на 37 градусов по Цельсию. Сосредоточьтесь на флуоресценции репортера с помощью RFP-лазера или фильтра.

Введите процент мощности лазера на 50% и время экспозиции на 100 миллисекунд для Венеры и RFP в качестве отправной точки, чтобы определить оптимальные настройки для эксперимента. Включите захват в реальном времени и проверьте полученное изображение и отображаемые гистограммы для обоих каналов. Если сигнал слабый и изображение трудно разобрать, увеличивайте процент мощности лазера и/или время экспозиции с шагом до тех пор, пока сигнал и изображение не будут выглядеть хорошо.

Затем выберите или откройте модуль Z stack в программном обеспечении микроскопа. Регулируйте фокус в одном направлении до тех пор, пока ячейка не перестанет быть видна. Выберите эту позицию в качестве верхней.

Отрегулируйте фокус в обратном направлении до тех пор, пока ячейка снова не станет видимой, и выберите это положение в нижней части. Выберите оптимальный размер шага и приступайте к сбору данных. При необходимости отрегулируйте гистограмму дисплея для улучшения визуального проявления флуоресцентного сигнала.

Наконец, используйте программное обеспечение для трехмерного рендеринга для реконструкции 3D-изображения. Если источник углекислого газа доступен, поместите устройство подачи углекислого газа на верхнюю часть держателя пластины. Установите уровень углекислого газа на 5% и включите контроллер углекислого газа в программном обеспечении.

Перейдите к полю с трансфицированными клетками. Визуализируйте изображение клеток в реальном времени, полученное камерой и отображаемое программным обеспечением для сбора данных на экране компьютера с помощью RFP-лазера. Затем введите настройки для процентной мощности лазера и времени экспозиции для RFP-лазера.

Затем введите настройку для процентной мощности лазера и времени экспозиции для лазерного излучения YFP. Для каждой лунки пластины выберите ряд различных положений, содержащих одну или несколько ячеек, выражающих репортер. Введите временной интервал между каждым кадром временных интервалов и общее количество кадров, которые должны быть сделаны.

Возвращайтесь к каждой позиции, корректируйте и обновляйте фокус по мере необходимости. Начните таймлапс и сохраните данные. Наконец, проанализируйте данные с помощью доступного программного обеспечения для обработки изображений, как описано в текстовом протоколе.

Здесь показан пример каспазы-2 BiFC после повреждения ДНК. Клетки обрабатывали одним ингибитором топоизомеразы: Камптотекином. Красный флуоресцентный белок, mCherry, был использован в качестве репортера, чтобы показать, что клетки экспрессируют зонд BiFC и помочь визуализировать общее количество клеток.

Флуоресценция Венеры показана зеленым цветом, а крупные точки представляют близость, индуцированную каспазой-2. Чтобы обеспечить визуализацию субклеточной локализации активационного комплекса каспазы с высоким разрешением, отдельные клетки могут быть визуализированы в трех измерениях. Активация каспазы-2 показана здесь зеленым цветом, а ядро — красным.

Отображается вид ортогональных срезов ячейки, где плоскость xy, плоскость yz и плоскость xz могут быть визуализированы параллельно. Трехмерное изображение также может быть отображено в видеоролике, где ячейка поворачивается вокруг оси y. Для получения кинетических данных о каспазе BiFC может быть использована покадровая визуализация.

В этом фильме показана активация каспазы-2 зеленым цветом после лечения ингибитором протеасом: бортезомибом. Митохондрии показаны красным цветом. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать каспазу BiFC для отслеживания сборки комплексов активации каспазы в режиме реального времени и четкого определения размера, формы и локализации производимых комплексов.

В этом протоколе изложено несколько подходов к сбору результатов эксперимента с каспазой BiFC, основанных на микроскопе; Тем не менее, следует отметить, что ряд вариаций и комбинаций этих подходов может быть использован для творческого исследования путей активации каспаз. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о контроле артефактов, вызванных микроскопией, таких как фототоксичность и фотообесцвечивание. В сопроводительном текстовом протоколе содержатся советы по достижению этой цели.

Решение о том, какой метод сбора и анализа следует использовать, будет определяться периметрами, которые будут исследованы, и доступностью контрольно-измерительного оборудования и программного обеспечения для визуализации. После этой процедуры для интерпретации данных можно использовать подходы к анализу изображений. Можно измерить изменения интенсивности флуоресценции с течением времени или процентное содержание флуоресцентных элементов.

Также можно рассчитать количество фокусов или размер объекта.