Визуализация активации каспаз в моноцитарных макрофагах человека

В иммунных клетках каспаза-1, воспалительная каспаза, является ключевым иммуночувствительным компонентом, который существует в неактивной форме. Эти неактивные формы состоят из про-домена, слитого с каталитическим доменом, и становятся активными посредством димеризации, вызванной близостью.

Чтобы визуализировать активацию каспаз in vivo, начните с культуры трансфицированных макрофагов, полученных из моноцитов человека, экспрессирующих красные флуоресцентные белки и пару флуоресцентных комплементационных репортерных белков. Репортерные белки содержат продомен каспазы-1, слитый с нефлуоресцентными фрагментами белка Венеры, либо Venus-N, либо Venus-C.

Обрабатывайте клетки средой визуализации, содержащей липополисахариды — бактериальный стимулятор воспаления, и ионофоры калия — нигерицин.

Липополисахариды взаимодействуют с рецепторами распознавания образов на макрофаге, инициируя сборку инфламмасомного комплекса.

Молекулы нигерицина проникают в клетку и связываются с ионами калия, вызывая их отток во внеклеточную среду и снижая внутриклеточную концентрацию ионов калия. Это приводит к праймингу сенсорных белков инфламмасомы с адапторными белками — белком-мостом между сенсорным белком и прокаспазой-1, образуя комплекс.

Продомены, содержащие фрагменты Венеры, взаимодействуют с адапторными белками комплекса. Это приводит к тому, что два фрагмента находятся в непосредственной близости, заставляя их пересматриваться и флуоресцировать.

Визуализируйте клетки под эпифлуоресцентным микроскопом.

Трансфицированные клетки имеют красный цвет с зелеными флуоресцентными пятнами, подтверждающими активацию каспаз.

Возьмите стерильную микропробирку объемом 1,5 миллилитра на трансфекцию и добавьте в капюшон соответствующую репортерную плазмиду и плазмиды каспазы-BiFC. Поместите станцию для дозатора, устройство, наконечники, электропориционные трубки и пипетку в стерильный колпак с ламинарным потоком. Подключите и включите нуклеофекционное устройство.

Введите параметры трансфекции на открывшемся стартовом экране. Нажмите на Voltage, введите 1,000 и нажмите Done, чтобы установить напряжение на 1000 вольт. Нажмите на Ширину, введите 40 и нажмите Готово, чтобы установить импульс на 40 миллисекунд. Наконец, нажмите на # Импульсы, введите два и нажмите Готово, чтобы установить количество электрических импульсов равным 2.

Возьмите одну из электропорационных трубок и заполните ее тремя миллилитрами электролитического буфера Е комнатной температуры. Вставьте электропорационную трубку в держатель пипетки на пипеточной станции, убедившись, что электрод сбоку трубки обращен внутрь, а при вставке трубки слышен щелчок.

Возьмите клеточную гранулу и добавьте 10 микролитров предварительно подогретого ресуспензионного R-буфера для каждого из 1-2 умножить на 10 к пятым клеткам, и аккуратно перемешайте микропипеткой P20. Добавьте 10 микролитров клеточной суспензии в каждую трансфекционную трубку и аккуратно перемешайте микропипеткой P20. Вставьте наконечник в пипетку, нажав кнопку «Нажим» до второго упора, убедившись, что зажим полностью захватывает монтажный шток поршня в наконечнике.

Затем нажмите кнопку «Нажмите» на пипетке до первой остановки и опустите в первую пробирку, содержащую смесь клеточной или плазмидной ДНК, чтобы аспирировать образец. Очень осторожно вставьте пипетку с образцом в держатель для дозатора, следя за тем, чтобы пипетка защелкнулась и была правильно размещена. Нажмите кнопку «Пуск» на сенсорном экране и подождите, пока не будут поданы электрические импульсы.

Медленно извлеките пипетку из станции и немедленно добавьте трансфицированную клеточную суспензию в соответствующую лунку с предварительно подогретой средой, не содержащей антибиотиков, медленно нажимая кнопку до первой остановки. Осторожно покачивайте планшет с трансфицированными клетками и инкубируйте в течение одного-трех часов в инкубаторе для культур увлажненных тканей. Затем в каждую лунку добавьте по 200 микролитров предварительно подогретой питательной среды.

Поместите чашку в инкубатор и подождите не менее 24 часов для экспрессии генов. На следующий день проверяют жизнеспособность клеток и эффективность трансфекции с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.

Осторожно удалите среду из клеток с помощью микропипетки P1000 и добавьте 500 микролитров раствора для стимуляции вниз по стенке лунки. Чтобы запустить необработанные контрольные лунки, добавьте среду визуализации без стимула.

Чтобы визуализировать клетки с помощью эпифлуоресцентного или конфокального микроскопа, включите микроскоп и источник флуоресцентного света, следуя инструкциям производителя. Выберите объектив «10 или 20 раз» и поместите чашку для культивирования на предметный столик микроскопа.

Найдите ячейки под 568-нанометровым фильтром с помощью окуляра и сосредоточьтесь на клетках, экспрессирующих репортерные эритроциты. Посчитайте все красные клетки в поле зрения. Находясь в том же поле зрения, переключитесь на фильтры 488 или 512. Подсчитайте количество красных клеток, которые также имеют зеленый цвет. Насчитайте не менее 100 красных клеток минимум трех полей.