Электрохимические обнаружения от дейтерия кинетическая изотопный эффект на внеклеточные переноса электронов в Shewanella oneidensis MR-1

Общая цель данного протокола заключается в наблюдении за вкладом транспорта протонов в скорость бактериального внеклеточного транспорта электронов путем обнаружения кинетического изотопного эффекта дейтерия. Наш метод раскрывает влияние транспорта протонов на кинетику внеклеточного транспорта электронов или ЭЭТ от бактерий к электроду через цитохромы c-типа на внешней мембране. Наш анализ отражает нативное управление протонами при ЭЭТ, потому что мы использовали живые бактерии, а не очищенный фермент.

Однако наша задача заключалась в том, чтобы устранить шумы от других клеточных процессов. Кинетический изотопный эффект дейтерия, называемый KIE, является одним из лучших методов для изучения вклада транспорта протонов в связанный с ним процесс переноса электронов. Чтобы вырастить клетки Shewanella MR-1, перенесите одну колонию клеток, выращенных на агаровой пластине, в 15 миллилитров среды LB.

Выращивайте клетки при температуре 30 градусов Цельсия в течение 24 часов в аэробных условиях с встряхиванием при 160 оборотах в минуту. Центрифугируйте клеточную суспензию при 6 000-кратном весе в течение 10 минут. Затем ресуспендируйте полученную клеточную гранулу в 15 миллилитрах определенной среды, добавив 10 миллимолярного лактата в качестве источника углерода и 0,5 грамма на литр дрожжевого экстракта в качестве микроэлементов для клеток.

После дальнейшего аэробного культивирования клеточной суспензии при температуре 30 градусов Цельсия в течение 12 часов с встряхиванием при 160 об/мин, снова центрифугируйте при 6000-кратном давлении в течение 10 минут. Перед электрохимическим экспериментом дважды промойте полученную клеточную гранулу средой DM центрифугированием в течение 10 минут при 6 000-кратном тепере силы тяжести. Чтобы построить трехэлектродный электрохимический реактор, поместите подложку ITO в качестве рабочего электрода на дно реактора.

Затем вставьте стеклянный цилиндр и крышку из политетрафторэтилена, а также вставьте платиновую проволоку в качестве противоэлектрода. Затем вставьте электрод из хлорида серебра в реактор в качестве электрода сравнения. Далее добавьте в электрохимический реактор четыре миллилитра ДМ с добавлением 10 миллимолярного лактата и 0,5 грамма на литр дрожжевого экстракта.

После подтверждения отсутствия утечки из электрохимического реактора подайте газообразный азот в электрохимический реактор в течение 20 минут для поддержания анаэробных условий внутри электрохимического реактора. Подключите электрохимический реактор к потенциостату и подайте положительное напряжение 0,4 вольта на электрод ITO, поддерживая температуру электрохимического реактора на уровне 30 градусов Цельсия с помощью внешней системы циркуляции воды. Чтобы выполнить электрохимическое культивирование, сначала отрегулируйте плотность клеток суспензии до оптической плотности 1,43 на 600 нанометрах с ДМ с добавлением 10 миллимолярного лактата и 0,5 грамма на литр дрожжевого экстракта.

Добавить 0,3 миллилитра клеточной суспензии в электрохимический реактор через инъекционный порт с помощью шприца. Наружный диаметр 600 в реакторе меняется на 0,1. Продолжайте подачу потенциала при положительном напряжении 0,4 вольта на электрод ITO в течение 25 часов.

Остановите применение потенциала и отключите электрохимический реактор от потенциостата и системы циркуляции воды. Налейте газообразный азот в бутылку, содержащую DM с 10 миллимолярным лактатом, в течение 20 минут, чтобы удалить кислород из среды. Теперь очень медленно и аккуратно удалите всю надосадочную жидкость изнутри электрохимического реактора с помощью шприца под протекающим газообразным азотом.

Затем добавьте четыре миллилитра свежего СВ, содержащего 10 миллимолярного лактата, с помощью шприца. Наклоните электрохимический реактор, чтобы удалить всю надосадочную жидкость со стенки реактора. Повторите эти действия в общей сложности три раза.

Остановите подачу газа и снова подключите электрохимический реактор к потенциостату, подав положительное напряжение 0,4 вольта на электрод ITO на 303 Кельвина. Подтвердите, что в настоящее время продукция из монослойной биопленки Shewanella MR-1 стабильна и не увеличивается быстро. Если течение резко увеличивается, подождите, пока течение стабилизируется с увеличением на 5% в течение 10 минут.

Очень медленно и осторожно добавьте 40 микролитров бескислородного 50 объемного процента D2O в электрохимический реактор с помощью шприца таким образом, чтобы концентрация составляла 0,5 объемного процента D2O в реакторе. Чтобы предотвратить повреждение биопленки при добавлении D20, вводите D2O по каплям. Дождитесь стабилизации течения и впоследствии прибавьте D2O до 4,4 объемных процентов, чтобы получить значение KIE, которое представляет собой отношение текущего производства и наличия D2O и H2O.

Проверьте влияние того же объема добавления H2O на текущее производство. В данном случае сплошная линия является репрезентативным результатом изменения микробного тока, вызванного добавлением D2O. Добавление D2O резко снижало микробный ток в течение 10 секунд, в то время как H20 почти не снижал ток, как показано пунктирной линией.

Чтобы подтвердить, что наблюдаемое снижение тока на D2O связано с транспортом электронов через цитохромы внешней мембраны, был использован диффузионный электронный медиатор. При этом добавление 100 микромолярных альфа-AQS увеличило текущую продукцию более чем в пять раз, и на текущую продукцию не повлияло добавление D2O. Эти результаты указывают на то, что кинетика метаболических реакций достаточно быстра, чтобы процесс внеклеточного переноса электронов ограничивал скорость.

Альтернативным методом оценки этого является добавление молекулы флавина в электрохимический реактор. Мгновенное увеличение анодного тока при добавлении флавина указывает на ограничение скорости процессом переноса электронов через цитохромы внешней мембраны. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как исследовать влияние кинетических изотопов на процесс внеклеточного транспорта электронов.

Наиболее важным моментом для успешного получения кинетического изотопного эффекта является выяснение и подтверждение условия, при котором транспорт электронов через цитохромы внешней мембраны ограничивает скорость производства тока. В этом видео мы представили два метода для подтверждения этого состояния: наблюдение за изменением тока при добавлении флавина и при добавлении диффузионного дополнительного медиатора, такого как альфа-AQS. Как только ограничение скорости будет подтверждено, эта система может быть использована не только для эксперимента с дейтерием, но и для биохимической характеристики цитохромов внешней мембраны.

Кроме того, этот протокол может быть применим для исследования других электроактивных микробов, при условии, что процесс внеклеточного переноса электронов ограничен скоростью. Наша методология представляет собой базовую и общую методику исследования процесса внеклеточного транспорта электронов через цитохромы внешней мембраны in vivo.