Быстрый и количественный метод для столб-поступательные изменения и вариант включено сопоставление пептидов в геномов

Общая цель этого программного протокола состоит в том, чтобы продемонстрировать использование PoGo для картирования пептидов с соответствующими посттрансляционными модификациями и количественной информацией из экспериментов по масс-спектрометрии для референсных геномов, а также обеспечить интеграцию и визуализацию с данными ортогональной геномики. Этот инструмент может помочь добавить геномную информацию в списки пептидов, сгенерированные в результате масс-спектрометрического протеомного поиска, чтобы облегчить интеграцию с данными секвенирования РНК. Основное преимущество этого инструмента заключается в том, что он прост в использовании, быстр и поддерживает дополнительную информацию, такую как посттрансляционные модификации, количественное определение и вариация аминокислот.

Для начала загрузите и установите программное обеспечение, показанное в этом видео, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. После установки перейдите в папку исполняемых файлов PoGo GUI и запустите программу, дважды щелкнув значок PoGo GUI. Используйте кнопку выбора рядом с исполняемым файлом PoGo.

Затем перейдите в папке исполняемых файлов в соответствующую подпапку операционной системы и выберите исполняемый файл PoGo. Подтвердите его выбор, нажав кнопку открыть. Затем выберите эталонный входной файл для последовательностей белков, нажав кнопку Выбрать.

Перейдите в папку с данными и выберите файл быстрого дня перевода. Подтвердите его выбор, нажав кнопку «Открыть». Выберите файл аннотации к расшифровке с помощью кнопки выбора.

Затем перейдите в папку с данными, выберите файл аннотации GTF и нажмите кнопку «Открыть». Добавьте файл идентификации пептида с помощью кнопки «Добавить» рядом с файлами пептидов. Здесь выберите файл в поддерживаемом формате MZ Tab, MZ Ident ML или MZ ID или в формате четырех столбцов, разделенных табуляцией.

Кроме того, снимите флажки рядом с BED NGTF в окне выбора формата вывода. Оставляйте проверенными только PTM BED и GCT. Затем выберите подходящий вид для данных из выпадающего списка и начните картографирование, нажав кнопку «Пуск».

Сначала загрузите выходной файл PoGo, заканчивающийся на _ptm. bed, в средство просмотра интегративной геномики. Повторите эти действия, чтобы также загрузить файл, заканчивающийся на _noptm.bed.

Этот файл содержит все найденные пептиды без каких-либо модификаций. Изменяйте порядок треков, перетаскивая их в нужное место в списке. Каждый файл будет отображаться в виде отдельных дорожек с именем файла, идентифицирующим дорожку.

Каждый трек изначально показан в свернутом виде. Чтобы развернуть их, щелкните правой кнопкой мыши по названию трека и выберите «Развернуто» для полного просмотра пептидов, включая последовательности. Теперь загрузите файл, заканчивающийся на gct.

Этот файл содержит информацию о количественном отношении пептида. В отличие от ранее загруженных файлов, каждый аннотированный образец будет загружен как отдельная дорожка. При необходимости реорганизуйте образцы с помощью операций перетаскивания.

Перемещайтесь по геному, выбирая хромосому в выпадающем меню, щелкая и удерживая участок хромосомы для увеличения, или вводя геномные координаты. Сопоставление PoGo может быть выполнено с помощью графического пользовательского интерфейса или через интерфейс командной строки. В этой части протокола интерфейс командной строки используется для выделения взаимозаменяемости.

Чтобы сопоставить пептиды вариантов, полученные на предыдущих этапах текстового протокола, с референсным геномом, откройте командную строку и перейдите в папку исполняемых файлов PoGo. Затем введите команду, показанную здесь. Подтвердите выполнение, нажав клавишу Enter, и дождитесь завершения выполнения, прежде чем двигаться дальше.

Визуализируйте пептиды, картированные без несоответствия и с несоответствием в просмотрщике интегративной геномики. В программном обеспечении с графическим интерфейсом пользователя PoGo добавьте файлы идентификации пептидов с помощью кнопки «Добавить» рядом с файлами пептидов и выберите один или несколько файлов, а также перетащите их в пустое поле под файлами пептидов. Затем снимите флажки рядом с PTM BED, GTF и GCT в разделе формата вывода и оставьте отмеченным только BED.

Кроме того, выберите опцию «Объединять несколько входных файлов в один выходной». В результате получится единый выходной файл, объединяющий все пептиды входных файлов. Если оставить эту опцию невыбранной, это приведет к последовательному выполнению программы для каждого входного файла отдельно.

Затем выберите соответствующие виды для данных из раскрывающегося списка, которые согласуются с файлами NGTF для быстрого дня. После выбора запустите сопоставление, нажав кнопку «Пуск». Чтобы создать трековый хаб из картированных пептидов, откройте окно терминала и введите следующую команду в командную строку.

Подтвердите выполнение, нажав клавишу ввода. Выполнение займет совсем немного времени. После этого перенесите сгенерированный хаб треков со всем его содержимым на веб-сервер FTP или GitHub.

В веб-браузере перейдите в браузер генома UCSC и выберите My Data Track Hubs. Затем нажмите на вкладку «Мои хабы». Скопируйте URL-адрес концентратора трека в текстовое поле, а затем загрузите концентратор трека, нажав кнопку Добавить концентратор.

Наконец, выберите браузер генома, чтобы перейти в режим браузера. Пользовательский хаб трека будет отображаться в верхней части списка. Если основой для концентратора дорожки является несколько файлов BED, каждый из файлов будет представлен в виде отдельной дорожки в концентраторе.

Здесь сравниваются PoGo и два других инструмента протеогеномного картирования по их общему использованию памяти и времени аналитического выполнения. PoGo значительно превосходит другие инструменты как по скорости, так и по памяти, и он способен отображать посттрансляционные модификации и количественную информацию, связанную с пептидами, на геном. PoGo использует опцию раскрашивания, чтобы обеспечить простую визуальную помощь в отношении уникальности пептидного картирования в геноме.

Сопоставления красным цветом указывают на уникальность одного транскрипта, в то время как блочные выделения указывают на сопоставление с одним геном. Серые карты показывают пептиды, общие для нескольких генов. Опция PTM BED в PoGo переопределяет цветовой код для учета различных типов посттрансляционных модификаций, указывая местоположение модификации толстым блоком на остатке модифицированной аминокислоты.

В показанных здесь данных протеома, представляющих колоректальный рак, были идентифицированы только два пептида, каждый из которых демонстрировал одно фосфорилирование. Информация в выходном файле GCT содержит количественные значения для областей генома, покрытых пептидами. Пептиды, проходящие через сплайс-соединения, делятся на свои части, не соединяясь.

Для получения более полной информации о сплайсинге дополнительно требуется выходной файл GTF. После загрузки и настройки последовательностей референсных белков и аннотаций тысячи пептидов могут быть отображены по геномным координатам менее чем за пять минут, при этом не допускаются несоответствия последовательностей. При попытке картирования пептидов на референсные геномы с помощью PoGo важно помнить об использовании транслируемых последовательностей транскриптов, кодирующих белки, и связанных с ними аннотаций транскриптов.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как использовать PoGo и PoGo GUI для отображения пептидов из протеомных масс-спектрометрических экспериментов с связанной информацией с эталонными геномами и их визуализации.