Скрининг для функционального Некодирующих генетических вариантов Использование электрофоретической подвижности Сдвиг анализа (EMSA) и ДНК-сродства осадков Анализ (DAPA)

Общая цель этой экспериментальной стратегии заключается в исследовании функциональности некодирующих вариантов, связанных с заболеванием. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы геномики, например, как генетические варианты, которые на самом деле не изменяют аминокислотную последовательность, все же вносят свой вклад в фенотип заболевания. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает оптимизированный процесс оценки генетической изменчивости функциональной активности и дает представление о регулирующих белках и воздействующих путях.

Этот метод может принести пользу при исследовании любого заболевания с потенциальным причинным вариантом. Потому что процедура анализа этих вариантов универсальна вне зависимости от изучаемого фенотипа. Хотя этот метод может дать представление о болезнях человека, он также может быть применен к мутациям в любом организме.

В этом эксперименте ядерные лизаты будут получены из В-лимфобластоидных клеток, однако эта процедура может быть применена к большинству клеточных линий. После подсчета клеток с помощью гемоцитометра раскрутите вниз нужное количество клеток для лизинга. Аспирируйте среду, добавьте 10 миллилитров ледяного PBS и снова раскрутите клетки.

Промойте ячейки второй раз PBS, а после отжима удалите PBS. Ресуспендируйте небо клетки в ледяном PBS, используя один миллилитр PBS на 10-7 клеток. Квотируйте один миллилитр клеточной суспензии на 1,5 миллилитровые микроцентрифужные пробирки, таким образом, чтобы каждая пробирка содержала от 10 до седьмой клетки в PBS.

Центрифугируйте в течение двух минут и отсасывайте из PBS. Добавьте к рабочему запасу буфер CE, один миллимолярный дитиотреитол, или DTT, 1X ингибитор фосфатазы и 0,5 миллимоляра фенилметансульфонилфторида, или PMSF. Повторно суспендируйте каждую клеточную палитру с 400 микролитрами этого буфера, и инкубируйте на льду в течение 15 минут.

Добавьте 25 микролитров 10% Nonidet P-40 в каждую микроцентрифужную пробирку и перемешайте с помощью пипетирования. Центрифугируйте при температуре четыре градуса Цельсия и максимальной скорости в течение трех минут. Сцедите и выбросьте надосадочную жидкость.

Далее добавьте к рабочему запасу NE-буфера один миллимолярный DTT, 1X ингибитор фосфоаазы и один миллимолярный PMSF. Повторно суспендируйте каждое небо клетки 30 микролитрами этого буфера и перемешайте путем вортексирования. Инкубировать при температуре 4 градуса Цельсия, в трубчатом ротаторе, в течение 10 минут.

Центрифугируйте в течение двух минут. Соберите прозрачную надосадочную жидкость, которая является ядерным лизатом. Аликвотируйте ядерный лизат перед хранением при температуре минус 80 градусов Цельсия, чтобы избежать многократных циклов замораживания и оттаивания, которые могут привести к ухудшению белка.

Начните эту процедуру с подготовки 50 наномолярного рабочего запаса олигонуклеотида, как описано в тексте протокола. Поместите олигос в нагревательный блок при температуре 90 градусов Цельсия на пять минут. Через пять минут выключите нагревательный блок и дайте олиго медленно остыть до комнатной температуры в течение как минимум одного часа перед использованием.

Затем приготовьте электрофоретический анализ сдвига подвижности или гель EMSA. Снимите предметное стекло с предварительно изготовленного геля с шестипроцентным трис-боратом-ЭДТА или КЭБ и промойте под деионизированной водой несколько раз, чтобы удалить буфер из лунок. Соберите аппарат для гель-электрофореза и проверьте наличие утечек, заполнив внутреннюю камеру буфером 0,5X TBE.

Если буфер не просачивается во внешнюю камеру, заполните внешнюю камеру примерно на две трети. Предварительно запустите гель при напряжении 100 вольт в течение 60 минут. Когда предварительный запуск будет завершен, промойте каждую лунку 200 микролитрами буфера 0,5X TBE.

Приготовьте связующий буфер мастер-микса. В микроцентрифужной пробирке смешайте эти реагенты, которые являются общими для всех реакций. 10X связывающий буфер, полисорбат DTT, Poly(dI-dC) и ДНК спермы лосося.

Чтобы запустить реакции EMSA, добавьте в каждую микроцентрифужную пробирку воду, не содержащую нуклеаз, таким образом, чтобы итоговый объем после добавления всех реагентов составил 20 микролитров. Добавьте соответствующее количество исходной смеси в каждую микроцентрифужную пробирку. Добавьте восемь микрограммов ядерного лизата в соответствующие микроцентрифужные пробирки.

Включите пробирки, содержащие олиго, без ядерного экстракта, в качестве отрицательного контроля. Добавьте 50 фемтомолев олиго в соответствующие микроцентрифужные пробирки и перемешайте. Кратковременно открутите содержимое до дна трубки.

Инкубируйте все трубки в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем добавьте два микролитра оранжевого загрузочного красителя 10X в каждую микроцентрифужную пробирку. Пипеткой вверх и вниз перемешивайте.

Загрузите образцы в предварительно прогонный шестипроцентный гель TBE, пипетируя вверх и вниз для смешивания, а затем вытолкните каждый образец в отдельную лунку. Запустите гель при напряжении 80 вольт в течение примерно 60-75 минут, пока оранжевый краситель не пройдет от двух третей до трех четвертей пути вниз по гелю. Когда прогон будет завершен, с помощью гелевого ножа подденьте пластиковую кассету.

Извлеките гель из кассеты и поместите его в контейнер с 0,5-процентным буфером TBE, чтобы предотвратить его высыхание. Поместите гель на поверхность инфракрасной и хемилюминесцентной системы визуализации. Устраните любые пузыри или загрязнения, которые могут нарушить изображение.

Отсканируйте гель с помощью программного обеспечения системы сканирования, как описано в тексте протокола. Чтобы начать эту процедуру, подготовьте рабочий состав из пяти микромолярных олиго, как описано в тексте протокола. Поместите олигос в термоблок при температуре 95 градусов Цельсия на пять минут.

Через пять минут выключите нагревательный блок и дайте олигосу медленно остыть до комнатной температуры перед использованием. Нагрейте следующие буферы до комнатной температуры: буфер связывания, буфер промывки низкой жесткости, буфер промывки высокой жесткости и буфер элюирования. Приготовьте связующие смеси для каждого варианта.

Смешайте один объем ядерного лизата с двумя объемами связывающего буфера. Добавьте 1X ингибитор фосфатазы, 0,5 миллимоляра PMSF и 1X усилитель связывания. Добавьте 10 микролитров пяти микромолярных биотинилированных захватывающих ДНК в каждую связывающую смесь.

Перемешайте, несколько раз щелкнув тюбиком. Выдержать связующие смеси в течение 20 минут при комнатной температуре. Далее добавьте 100 микролитров стрептавидина MicroBeads в каждую связующую смесь.

Выдерживать 10 минут при комнатной температуре. Для каждого испытуемого олигозонда поместите в магнитный сепаратор обвязочную колонку. Убедитесь, что столбцы помечены вариантом олиго, который использовался в связующей смеси.

Поместите микроцентрифужную пробирку непосредственно под каждую связующую колонку и нанесите 100 микролитров связующего буфера для промывки колонки. Разложите пипеткой содержимое каждой связующей смеси в отдельные колонки. Дайте жидкости полностью протекать через колонну в микроцентрифужную трубку.

Нанесите на колонку 100 микролитров промывочного буфера низкой строгости и подождите, пока резервуар для колонки опустеет. Снова нанесите на колонку 100 микролитров промывочного буфера низкой жесткости. Нанесите на колонку 100 микролитров промывочного буфера высокой прочности и подождите, пока резервуар колонки опустеет.

Снова нанесите на колонку 100 микролитров промывочного буфера высокой жесткости. Добавьте в колонку 30 микролитров нативного буфера для элюирования и дайте постоять пять минут. Наконец, добавьте еще 50 микролитров нативного элюирующего буфера для элюирования связанных транскрипционных факторов.

Для изучения воспроизводимости результатов EMSA и последствий циклов замораживания и размораживания олигонухим веществам, содержащим референтный или нереференсный аллель генетического варианта, использовали для зондирования одного и того же препарата ядерного экстракта В-лимфоцитов после нескольких циклов замораживания и размораживания. Синяя стрелка указывает на свободный щуп. Связывание транскрипционных факторов с олиго проявляется в виде полосы в верхней половине геля, обозначенной красной стрелкой.

Эти результаты указывают на то, что замораживание и размораживание этого конкретного ядерного экстракта до пяти раз, по-видимому, никак не влияет на целостность белков. Также важно оптимизировать соотношение сигнал/шум для EMSA. Различные концентрации олигопластов использовались для зондирования одного препарата ядерного лизата.

Наблюдалось увеличение интенсивности полосы, до 100 фемтомолев олиго. Здесь представлены репрезентативные результаты исследования аллеля риска, связанного с волчанкой. Фактор транскрипции, STAT 1, был впервые идентифицирован с помощью DAPA с последующим протеомным анализом.

Затем вестерн-блоттинг DAPA подтвердил идентичность STAT 1 и более высокое связывание фосфорилированной формы STAT 1 с олиго риска волчанки. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как масс-спектрометрия и вестерн-блоттинг. Это поможет нам идентифицировать регуляторный белок, демонстрирующий аллель-зависимое связывание.

Репортерные анализы, такие как люцифераза, также могут быть использованы для изучения изменений в экспрессии генов в зависимости от аллеля.