Целевые метилирования ДНК Анализ Следующее поколение Секвенирование

Общая цель этой процедуры заключается в количественной оценке метилирования CPG в целевых областях геномной ДНК, выделенной из ткани или клеток, представляющих интерес. Это достигается путем предварительного проектирования сульфит-специфичных ПЦР-праймеров для амплификации интересующих областей из бисульфитной преобразованной геномной ДНК. На втором этапе интересующая область с бисульфитным преобразованием ампликонов усиливается, и из конов ампликонов генерируются библиотеки секвенирования следующего поколения или библиотеки NGS.

Далее происходит секвенирование библиотек и генерация файлов FASTQ для анализа. На заключительном этапе чтения секвенирования выравниваются с бисульфитной преобразованной эталонной целевой последовательностью, и пять процентов mc рассчитываются в конечном итоге с помощью секвенирования сульфитных ампликонов или BS a s может быть выполнен для точного количественного определения метилирования CPG в любой интересующей области из любого модельного организма. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как секвенирование по Сэнгеру, заключается в том, что BS A S обеспечивает точное и точное количественное определение метилирования CPG быстрым и высокопроизводительным способом, что дает возможность анализировать несколько областей в большом количестве образцов.

После идентификации мишени и проектирования праймера соберите реакцию для оптимизации амплификации мишени из одного ампликона, а затем запечатайте ПЦР-планшет с термосвариваемой пленкой для визуализации ампликонов с помощью страничного электрофореза. Далее загрузите в соответствующие лунки 30 микролитров ПЦР-реакций или лесенки, а затем запустите гель при напряжении 200 вольт в течение примерно 45 минут. Когда первый краситель достигнет конца геля, остановите реакцию и затем покройте весь гель пятью микрограммами на миллилитр свежеприготовленного бромида AUM.

Через пять минут визуализируйте гель с помощью УФ-транслюминатора с длиной волны возбуждения 482 нанометра. Используйте лестницу для определения размера ПЦР АМПЛИКОНС, чтобы определить специфичность реакции. Найдите несколько полос, отличных от ожидаемого размера ампликона, чтобы определить средний размер обнаруженных библиотечных пиков и оценить молярность.

Далее запустите библиотеки на чипе для определения размера ДНК с помощью капиллярного электрофореза с высокочувствительным анализом ДНК в соответствии с инструкциями производителя. Количественная оценка библиотек по QPCR. Используйте праймеры, разработанные для последовательностей адаптеров в сгенерированных библиотеках и стандартах с известной концентрацией на приборе реального времени, используя настройки абсолютного количественного определения в соответствии с инструкциями производителя.

Затем используйте размер библиотек и молярное количественное определение из QPCR для расчета молярных концентраций библиотек. После упорядочивания импортируйте сжатые быстрые Q-файлы в соответствующий конвейер анализа последовательности, выберите импорт, а затем выберите метод последовательности, используемый для создания операций чтения, чтобы сохранить оценки Q для приложений обрезки чтения. Импортируйте соответствующие заархивированные файлы быстрого чтения Q, а затем в разделе «Общие параметры» снимите флажок «Отбрасывать оценки качества».

Выберите место для импортированных операций чтения и нажмите кнопку «Готово». Затем в разделе Основные инструменты секвенирования сети сети (NGS core) выберите последовательности обрезки. Выделите чтения, которые нужно обрезать, сохранив только те чтения, которые содержат больше или равно Q 30 баллов.

Затем выберите обрезку с помощью оценок качества и установите ограничение на 0,001. Далее отбирать только те язычки, которые содержат меньше или равный одному неоднозначному нуклеотиду. Выберите параметр «Обрезать неоднозначные нуклеотиды» и установите максимальное количество неоднозначностей равным одному.

Затем выберите место для сохранения обрезанных прочтений и нажмите кнопку «Готово», чтобы сопоставить обрезанные данные с референсом на преобразованный ген in silico. В разделе Основные инструменты NGS выберите Чтение карты. Чтобы получить справку, выберите обрезанные чтения, которые необходимо сопоставить, и нажмите кнопку Далее.

Затем в разделе Маскирование ссылок выберите преобразованную последовательность ссылок и выберите Без маскирования. Нажмите «Далее», а затем присвойте оценку «Три» за несоответствия, вставки и удаления. Присвойте ссылочной карте оценку 1 для минимальной доли длины чтения и назначьте оценку 0,9 для минимальной доли идентичности между картой, чтением и ссылкой при обработке неспецифических совпадений, выберите, проигнорируйте и нажмите кнопку Далее в разделе Параметры вывода.

Затем выберите Создать автономные сопоставления для чтения. Затем в разделе «Обработка результатов» нажмите «Сохранить». Выберите расположение для сохранения сопоставления чтения и нажмите кнопку «Готово», чтобы запустить вызов варианта для сопоставленных операций чтения.

В разделе Анализ повторного секвенирования выберите обнаружение низкочастотных вариантов и выберите сопоставление чтения для анализа. Нажмите далее, а затем в разделе Низкочастотный вариант введите 0.01% и нажмите Далее. В разделе Общие фильтры установите минимальное покрытие равным 1000, чтобы гарантировать, что глубина последовательности больше или равна 1000 x.

Наконец, нажмите «Далее», а затем в разделе «Параметры вывода» выберите «Создать аннотированную таблицу» и выберите место для сохранения файла таблицы вариантов, нажмите «Готово» и используйте частоты вариаций на аннотированных сайтах CPG в интересующей области из файла таблицы вариантов для расчета частоты метилирования цитозина на референсном цитозине в контексте CG с помощью секвенирования сульфитных ампликонов, правильно выровненных по преобразованной референсной последовательности, которые будут похожи на изображенные на рисунке. На рисунке. Динуклеотиды CPG могут быть четко идентифицированы, а состояния метилирования могут быть оценены путем наблюдения за вызовами оснований в сайтах CPG. В картированных чтениях 0% метилирования приведет к картированным считываниям, содержащим тимин, картированным на сайты CPG.

Контроль 100% метилирования приведет к картированию прочтений, содержащих цитозины, картированных на сайты CPG. В этом эксперименте РНК и ДНК были совместно выделены из мыши, мозжечка и сетчатки. Экспрессия опсина, селективно экспрессируемая в ткани сетчатки, затем измерялась с помощью QPCR, как и ожидалось.

РНК опсина была обнаружена только в сетчатке после количественной оценки уровней метилирования CPG в промоторной области опсина с помощью секвенирования бисульфитной амплификации. Тем не менее, кумулятивные уровни метилирования в промоторной области были более 80% в мозжечке по сравнению с менее чем 15% в сетчатке. Количественное определение метилирования B SAS выигрывает от количественного определения метилирования по сайту, что позволяет сравнивать уровни метилирования на специфичной для CPG основе в любой заданной области генома.

Действительно, в этом эксперименте было обнаружено, что уровни метилирования CPG в промоторе опсина значительно выше в образцах мозжечка по сравнению с образцами сетчатки. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как количественно определить метилирование CPG в целевых областях геномной ДНК, выделенных из тканей или клеток.