Свет лист флуоресцентной микроскопии для захвата 4-мерного изображения эффектов модуляции напряжения сдвига на развивающихся сердце данио рерио
10 августа 2018 г.
Здесь мы представляем протокол для визуализации разработки сердца в zebrafish в 4-измерениях (4-D). 4-D изображений, через свет лист флуоресцентной микроскопии (LSFM), занимает 3-мерных изображений (3-D) со временем, чтобы реконструировать развивающихся сердца. Мы покажем, и количественно и качественно, касательное напряжение активирует эндокарда Notch сигнализации во время разработки камеры, которая способствует сердечной trabeculation.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области механобиологии развития сердца, такие как модуляция напряжения сдвига на трабекуляцию сердца с помощью сигнализации с помощью сигнализации с помощью 4D-светового листового микроскопа. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она освещает тонкий срез образца с плоскостью пять микрон, что приводит к меньшему фотообесцвечиванию и фотоповреждению. Кроме того, наш вычислительный алгоритм позволяет нам реконструировать в 4D бьющееся сердце рыбки данио.
Применение этого метода распространяется на диагностику врожденных пороков сердца, поскольку он позволяет invivo последовательно визуализировать сердечную трабекуляцию на ранней стадии развития вплоть до более позднего фенотипа. Как правило, люди, которые плохо знакомы с этой техникой, обнаружат, что мышление в трех измерениях с течением времени трудно представить. Кроме того, требуется время на создание системы и ее точную выверку.
Для начала разделите самцов и самок данио-рерио в аквариумах для разведения с помощью разделителя. Затем поднимите разделитель и дайте размножаться самцу и самке данио-рерио. Соберите эмбрионы рыбок данио и введите эмбриону морфолиго олиго, чтобы подавить трабекуляцию.
Далее приготовьте однопроцентный гель из агарозы, добавив один грамм агарозы в 100 миллилитров дистиллированной воды и нагревайте его до тех пор, пока вся агароза не растворится. Дайте агарозе остыть, а затем с помощью пипетки объемом 20 микролитров загрузите небольшую пластиковую пробирку с одним из подготовленных эмбрионов и агарозой. Закрепите трубку на предметном столике микроскопа и используйте объектив с десятью увеличениями.
Отрегулируйте объектив с помощью ручки так, чтобы верхняя часть эмбриона была в фокусе. Сделайте снимки всего эмбриона рыбы в течение нескольких циклов сердцебиения, используя световой лист толщиной пять микрон. Соберите 500 кадров xy с выдержкой десять миллисекунд.
Затем переместите стадию на один микрон в z-доступе к новому слою и повторите процедуру визуализации. Продолжайте представлять 500 кадров в плоскости z, пока не будет полностью изображено все сердце. Затем откройте программу для обработки изображений и начните складывать изображения в 3D.
Для этого сначала нажмите на открытые данные. Здесь выберите все изображения, которые должны быть наложены в 3D, а затем нажмите кнопку Загрузить. Затем добавляем в воксель размер 0,65 на 0,65 на один микрон и нажимаем на ОК.
Ввод правильного размера воксела имеет решающее значение для точного анализа 3D-изображений. Теперь нажмите на окно просмотра мультиплана и визуализируйте 3D-изображение. Щелкните правой кнопкой мыши синий срез одноточечного tiff box, выберите «Отображать», а затем нажмите на «Волран».
В меню редактирования выберите параметры, а затем измените цветовую карту. Отрегулируйте цвет с помощью окошек, а затем нажмите OK. Находясь в программном обеспечении для обработки изображений, нажмите на файл и откройте данные временных рядов.
Выделите 3D тиффы, которые только что были созданы, нажав на кнопку «Загрузить», и введите тот же размер вокселя, что и раньше. Щелкните правой кнопкой мыши синий срез в виде одной точки tiff box, а затем выберите «Дисплей», а затем «Волран». Теперь нажмите на «Редактировать».
Выберите варианты. А затем выберите «Редактировать цветовую карту». Отрегулируйте цвет с помощью окошек, а затем нажмите OK.
Затем щелкните правой кнопкой мыши элемент управления временными рядами, выберите «Создатель фильма» и нажмите кнопку воспроизведения, чтобы посмотреть фильм. Чтобы закончить, добавьте имя файла, размер кадра, частоту кадров, качество, равное единице, и введите моноскопический. Затем нажмите «Применить».
Наконец, экспортируйте видео. Биомеханические силы, такие как гемодинамическое напряжение сдвига, тесно связаны с морфогенезом сердца. Здесь была использована световая флуоресцентная микроскопия для визуализации трабекулярных гребней, выступающих в просвет желудочка через 75 часов после оплодотворения.
Через 100 часов после оплодотворения можно ясно увидеть трабекулярную сеть. У эмбриона, получавшего микроинъекцию gata1aMO, кроветворение и вязкость снижаются на 90 процентов. Это снижало вязкость, ослабляло гемодинамическое напряжение сдвига, что приводило к задержке инициации и меньшей плотности трабекулярной сети.
Эту задержку и плотность трабекулярной сети удалось восстановить путем повышения регуляции экспрессии генов, связанных с notch, что привело к спасению формирования трабекуляров через 75 часов после оплодотворения и через 100 часов после оплодотворения. Таким образом, морфолигонуклеотиды gata1a снижают гемодинамические силы, что приводит к снижению регуляции передачи сигналов notch, в то время как Nrg1-мРНК спасает регулируемые гены, связанные с notch, и возобновляет трабекуляцию. После освоения эта техника визуализации может быть завершена примерно за два часа при правильном выполнении.
После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области развития сердца к изучению факторов в гене notch, которые отвечают за правильное формирование трабекуляции у рыбок данио. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как получать изображения с помощью микроскопии селективного плоского освещения и создавать файлы 4D-изображений. Не забывайте, что работа с лазерами может быть крайне опасной.
И во время этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение соответствующих очков.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В этой статье представлен протокол визуализации развивающихся сердец у данио с помощью 4-D микроскопии флуоресценции светового листа (LSFM). Метод позволяет восстановить развитие сердца во времени, раскрывая роль сдвигового напряжения в активации сигнального пути Notch в эндокардии во время развития камер.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Развитийная биология
- Кардиальная механобиология
- Методы визуализации
Предпосылки
- Понимание развития сердца важно для диагностики врожденных пороков сердца.
- Сдвиговое напряжение влияет на трабекуляцию сердца через сигнальный путь Notch.
- 4-D визуализация дает возможность понять динамические биологические процессы.
- Микроскопия светового листа минимизирует фотоотбеливание и повреждение.
Цель исследования
- Визуализировать развитие сердца у данио в реальном времени.
- Исследовать эффекты сдвигового напряжения на трабекуляцию сердца.
- Разработать вычислительный алгоритм для 4-D реконструкции сердца.
Используемые методы
- 4-D микроскопия флуоресценции светового листа (LSFM).
- Реконструкция биений сердца данио с помощью вычислительных алгоритмов.
- Последовательная визуализация стадий развития сердца.
- Анализ эффектов сдвигового напряжения на сигнальный путь Notch.
Основные результаты
- Сдвиговое напряжение активирует сигнальный путь Notch в эндокардии во время развития камер сердца.
- 4-D техника визуализации позволяет детально наблюдать трабекуляцию сердца.
- Снижение фотоотбеливания и повреждения улучшает качество визуализации.
- Метод помогает понять механизмы врожденных пороков сердца.
Заключения
- 4-D техника LSFM является мощным инструментом для исследования развития сердца.
- Полученные знания могут привести к лучшим методам диагностики врожденных пороков сердца.
- Будущие применения могут распространиться на другие области развитийной биологии.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Understanding hemodynamic forces in cardiac development provides mechanistic insights into congenital heart disease pathways, supporting target validation in preclinical models. Light-sheet fluorescence microscopy enables quantitative, dynamic visualization of shear stress effects on Notch signaling, a pathway implicated in ventricular non-compaction. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking biomechanical inputs to molecular outputs in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the causal relationship between hemodynamic shear stress and Notch signaling in trabeculation formation.
- Operational Value: Enables phenotypic screening of genetic and pharmacological modulators of cardiac morphogenesis.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by visualizing how reduced shear stress down-regulates Notch target genes and attenuates trabeculation.
- Operational Value: Facilitates rescue experiments, such as Nrg1 mRNA co-injection, to confirm target pathway specificity and reversibility.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative 4-D readouts of trabecular density and initiation timing for dose-response analysis.
- Operational Value: Standardizes imaging protocols across experimental conditions using synchronized light-sheet acquisition and voxel-based reconstruction.
- Scientific Value: Enables shear stress modulation via gata1a-MO to create controlled hypodynamic conditions for assay validation.
- Operational Value: Produces scalable, reproducible 3D+time datasets suitable for high-content analysis pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects endothelial Notch gene expression under pulsatile flow to in vivo trabeculation phenotypes, strengthening translational continuity.
- Operational Value: Provides a preclinical zebrafish model for studying Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy mechanisms.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by correlating molecular rescue (e.g., Nrg1) with phenotypic recovery of trabeculation.
- Operational Value: Supports cross-functional collaboration through shared 4-D visualization platforms for cardiology, genetics, and bioengineering teams.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of mechanotransduction pathways in cardiac development, bridging phenotypic screening to target validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing how shear stress modulates Notch signaling during ventricular chamber formation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on trabecular network dynamics for compound or genetic modifier evaluation.
- Analytics: Generates synchronized 4-D image stacks with voxel-scale precision, enabling statistical comparison of hemodynamic conditions.
- Translational Research: Links in vivo trabeculation phenotypes to in vitro endothelial flow responses, supporting biomarker alignment studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying hemodynamic influences across developmental and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanobiological pathway interpretation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through synchronized 4-D acquisition and computational reconstruction.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early phenotypic assessment of cardiac morphogenesis modifiers.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets involved in shear stress-Notch-trabeculation axes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, microinjection techniques, and light-sheet microscopy alignment.
- Dependent on specialized instrumentation including selective plane illumination microscopy and high-speed sCMOS cameras.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition parameters, voxel sizing, and time-series synchronization.
- Involves adaptation considerations when translating protocols across different genetic backgrounds or disease models.
- Limited by the physical accessibility of the embryonic heart and the need for precise temporal sampling across cardiac cycles.
