Свет лист флуоресцентной микроскопии для захвата 4-мерного изображения эффектов модуляции напряжения сдвига на развивающихся сердце данио рерио

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области механобиологии развития сердца, такие как модуляция напряжения сдвига на трабекуляцию сердца с помощью сигнализации с помощью сигнализации с помощью 4D-светового листового микроскопа. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она освещает тонкий срез образца с плоскостью пять микрон, что приводит к меньшему фотообесцвечиванию и фотоповреждению. Кроме того, наш вычислительный алгоритм позволяет нам реконструировать в 4D бьющееся сердце рыбки данио.

Применение этого метода распространяется на диагностику врожденных пороков сердца, поскольку он позволяет invivo последовательно визуализировать сердечную трабекуляцию на ранней стадии развития вплоть до более позднего фенотипа. Как правило, люди, которые плохо знакомы с этой техникой, обнаружат, что мышление в трех измерениях с течением времени трудно представить. Кроме того, требуется время на создание системы и ее точную выверку.

Для начала разделите самцов и самок данио-рерио в аквариумах для разведения с помощью разделителя. Затем поднимите разделитель и дайте размножаться самцу и самке данио-рерио. Соберите эмбрионы рыбок данио и введите эмбриону морфолиго олиго, чтобы подавить трабекуляцию.

Далее приготовьте однопроцентный гель из агарозы, добавив один грамм агарозы в 100 миллилитров дистиллированной воды и нагревайте его до тех пор, пока вся агароза не растворится. Дайте агарозе остыть, а затем с помощью пипетки объемом 20 микролитров загрузите небольшую пластиковую пробирку с одним из подготовленных эмбрионов и агарозой. Закрепите трубку на предметном столике микроскопа и используйте объектив с десятью увеличениями.

Отрегулируйте объектив с помощью ручки так, чтобы верхняя часть эмбриона была в фокусе. Сделайте снимки всего эмбриона рыбы в течение нескольких циклов сердцебиения, используя световой лист толщиной пять микрон. Соберите 500 кадров xy с выдержкой десять миллисекунд.

Затем переместите стадию на один микрон в z-доступе к новому слою и повторите процедуру визуализации. Продолжайте представлять 500 кадров в плоскости z, пока не будет полностью изображено все сердце. Затем откройте программу для обработки изображений и начните складывать изображения в 3D.

Для этого сначала нажмите на открытые данные. Здесь выберите все изображения, которые должны быть наложены в 3D, а затем нажмите кнопку Загрузить. Затем добавляем в воксель размер 0,65 на 0,65 на один микрон и нажимаем на ОК.

Ввод правильного размера воксела имеет решающее значение для точного анализа 3D-изображений. Теперь нажмите на окно просмотра мультиплана и визуализируйте 3D-изображение. Щелкните правой кнопкой мыши синий срез одноточечного tiff box, выберите «Отображать», а затем нажмите на «Волран».

В меню редактирования выберите параметры, а затем измените цветовую карту. Отрегулируйте цвет с помощью окошек, а затем нажмите OK. Находясь в программном обеспечении для обработки изображений, нажмите на файл и откройте данные временных рядов.

Выделите 3D тиффы, которые только что были созданы, нажав на кнопку «Загрузить», и введите тот же размер вокселя, что и раньше. Щелкните правой кнопкой мыши синий срез в виде одной точки tiff box, а затем выберите «Дисплей», а затем «Волран». Теперь нажмите на «Редактировать».

Выберите варианты. А затем выберите «Редактировать цветовую карту». Отрегулируйте цвет с помощью окошек, а затем нажмите OK.

Затем щелкните правой кнопкой мыши элемент управления временными рядами, выберите «Создатель фильма» и нажмите кнопку воспроизведения, чтобы посмотреть фильм. Чтобы закончить, добавьте имя файла, размер кадра, частоту кадров, качество, равное единице, и введите моноскопический. Затем нажмите «Применить».

Наконец, экспортируйте видео. Биомеханические силы, такие как гемодинамическое напряжение сдвига, тесно связаны с морфогенезом сердца. Здесь была использована световая флуоресцентная микроскопия для визуализации трабекулярных гребней, выступающих в просвет желудочка через 75 часов после оплодотворения.

Через 100 часов после оплодотворения можно ясно увидеть трабекулярную сеть. У эмбриона, получавшего микроинъекцию gata1aMO, кроветворение и вязкость снижаются на 90 процентов. Это снижало вязкость, ослабляло гемодинамическое напряжение сдвига, что приводило к задержке инициации и меньшей плотности трабекулярной сети.

Эту задержку и плотность трабекулярной сети удалось восстановить путем повышения регуляции экспрессии генов, связанных с notch, что привело к спасению формирования трабекуляров через 75 часов после оплодотворения и через 100 часов после оплодотворения. Таким образом, морфолигонуклеотиды gata1a снижают гемодинамические силы, что приводит к снижению регуляции передачи сигналов notch, в то время как Nrg1-мРНК спасает регулируемые гены, связанные с notch, и возобновляет трабекуляцию. После освоения эта техника визуализации может быть завершена примерно за два часа при правильном выполнении.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области развития сердца к изучению факторов в гене notch, которые отвечают за правильное формирование трабекуляции у рыбок данио. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как получать изображения с помощью микроскопии селективного плоского освещения и создавать файлы 4D-изображений. Не забывайте, что работа с лазерами может быть крайне опасной.

И во время этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение соответствующих очков.