Одной молекулы флуоресцентной микроскопии на Planar Поддерживаемые Бислои

В этом видео мы продемонстрируем, как подготовить и охарактеризовать биофункционализированные плоские поддерживаемые липидные бислои. Мы также подробно опишем архитектуру микроскопа с внутренним полным отражением, обладающего возможностью детектирования одиночных молекул. Мы измерим плотность мощности возбуждения, текучесть и плотность белков в липидном бислое.

Начнем с краткого введения в создание поддерживаемых на стекле плоских липидных бислоев. Когда малые однослойные везикулы контактируют с чистой стеклянной поверхностью, они разрываются и растекаются, образуя сплошной липидный бислой. В качестве материала для водной подушки мы обычно выбираем пальмитат.

Олеофосфатхолин или POPC является основным липидом, поскольку он образует жидкие липидные бислои при комнатной температуре и 37 °C. Для функционализации мы добавляем никель-антиокс, синтетический липид с хелатирующей никель головной группой, которая связывает белки с полигистидиновым тегом. Примерами являются костимулирующая молекула B7-1, молекула адгезии ICAM-1 и флуоресцентно меченый пептид-загруженный комплекс MHC для распознавания Т-клетками, как показано здесь; однако эта бислойная система в принципе может быть использована для изучения совершенно других процессов в различных биологических системах.

Благодаря особенностям планарной системы, события флуоресценции можно отслеживать в режиме полного внутреннего отражения, что существенно снижает клеточный фон и отлично подходит для флуоресцентной микроскопии одиночных молекул. Для подготовки липидов необходимы липиды POPC и никель-антиоксидант в хлороформе, а также чистая круглодонная колба. Растворите липиды в нужном соотношении в хлороформе и высушите их под вакуумом, как показано здесь. После воздействия высокого вакуума в течение ночи липиды образуют пленку на внутренней стенке колбы. Для регидратации липидов используйте дегазированный PBS, добавив 10 мл дегазированного PBS к высушенной липидной смеси.

Не перемешивать. Теперь, чтобы предотвратить окисление липидов, заполните колбу инертным газом, таким как азот или аргон, и осторожно прокрутите колбу. Липиды образуют молочно-белую суспензию.

Возьмите небольшой образец в качестве холостой пробы для спектрофотометра, чтобы предотвратить газообмен на следующем этапе. Очень важно правильно герметизировать колбу с липидной суспензией. Используйте термостойкую клейкую ленту, например, автоклавную ленту, для защиты от воздуха во время физического формирования в закрытой ультразвуковой бане.

После установки колбы запустите процедуру соникации при максимальной мощности 170 watts. Проводите соникацию в течение 60 минут. В результате физического воздействия мутность значительно снизилась.

Это можно проверить с помощью спектрофотометрии при 550 нанометрах. В качестве холостой пробы используйте аликвоту, взятую до соникации. Оптическая плотность при 230 нанометрах, указывающая на количество липидов, должна оставаться неизменной.

Здесь мы наполняем небольшие ультрацентрифужные пробирки одним миллилитром суспензии везикул и помещаем их в фиксированный ротор настольной ультрацентрифуги. Для подготовки бислоя крайне важно использовать только небольшие однослойные везикулы. Более крупные и плотные многослойные везикулы, которые также образуются при соникации, нарушают текучесть бислоя, поэтому их необходимо осадить и удалить с помощью центрифугирования.

Сначала проводится центрифугирование в течение одного часа при 150 000 G при комнатной температуре. Полученный супернатант затем центрифугируют еще восемь часов при 288 000 G при температуре четырех градусов Цельсия. Стеклянные подложки должны быть очень чистыми, чтобы липидные везикулы могли растечься по ним, образовав непрерывный и текучий бислой.

Для этого мы помещаем покровные стекла в тефлоновую форму, которую затем помещаем в стеккий сосуд. Соблюдайте крайнюю осторожность, используя средства защиты глаз, защитные перчатки и лабораторный халат; работайте в вытяжном шкафу. Мы добавляем одну часть 30% hydrogen peroxide, а затем три части концентрированной sulfuric acid для получения высокореакционноспособной и окислительной perio mono sulfuric acid.

Эта смесь бурно реагирует с органическими веществами, включая ткани кожи, слизистые оболочки глаз и волокна одежды. Она мгновенно нагревается. Инкубируйте предметные стекла в течение 30 минут.

Захватите покровное стекло пинцетом. Тщательно промойте обе стороны чистого покровного стекла от кислоты, используя дистиллированную или высококачественную деионизированную воду. Затем поместите стекло на тефлоновую подставку и дайте ему высохнуть не более 10 минут, чтобы иметь возможность создать несколько отдельных липидных бислоев одновременно. Высохшие покровные стекла приклеивают с помощью быстроотверждающего клея.

Используйте двухкомпонентный эпоксидный клей для приклеивания к камере Lab Tech на 8 или 16 лунок. Сначала осторожно извлеките исходное предметное стекло из рамки. Смешайте два компонента клея в соотношении один к одному.

Равномерно распределите клей по нижним желобам рамки камеры. Поместите чистый покровное стекло на покрытое клеем дно рамки камеры. Убедитесь, что клей равномерно распределен между предметным стеклом и пластиковой рамкой.

Дайте клею затвердеть в течение 30 минут. Разведите физическую суспензию липидов в PBS в соотношении 1:10 и профильтруйте через фильтр 0,2 мкм; внесите по 120 мкл данного разведения в каждую лунку восьмилуночного камерырованного слайда или по 60 мкл в каждую лунку шестнадцатилуночного камерырованного слайда. Убедитесь, что вся стеклянная поверхность покрыта, и подождите 20 минут.

Теперь бислой сформирован. Чтобы избавиться от остатков липидов, промойте каждую лунку 30 мл PBS. Ни в коем случае не допускайте контакта стеклянной поверхности с воздухом, так как это мгновенно разрушит бислой. Чтобы в каждой лунке был одинаковый объем буфера для последующего этапа декорирования белками, полностью заполните каждую лунку и удалите излишки жидкости с поверхности (жидкий купол).

Извлеките 330 µL. Таким образом, в каждой лунке останется около 350 µL. Для декорирования бислоя белками подготовьте мастер-микс, содержащий выбранные полигистидиновые белки, и добавьте по 50 µL этого микса в каждую лунку.

Белки связываются с никелевой анти-головной группой темного липида для обеспечения воспроизводимых результатов; перемешайте тщательно, но осторожно, и всегда инкубируйте в течение 60 минут для удаления несвязанных белков. Снова промойте 30 миллилитрами PBS. Теперь сосредоточимся на оборудовании для микроскопии.

Сначала мы продемонстрируем требования к микроскопии полного внутреннего отражения для объективной микроскопии поверхности. Для этого необходим иммерсионный объектив с высокой числовой апертурой. Входящий луч лазерного возбуждения отражается дихроичным зеркалом и фокусируется с помощью системы из двух или трех линз строго на заднюю фокальную плоскость объектива.

Затем лазерный луч проходит через объектив в виде сфокусированного пучка вдоль оптической оси. Таким образом, флуоресцентный образец освещается по всей его глубине. При смещении пучка перпендикулярно оптической оси пучок остается сфокусированным, но выходит из объектива под наклоном.

Если продолжать перемещение, в какой-то момент вы достигнете критического угла, при котором луч будет полностью отражаться на границе раздела между стеклянным покровным стеклом и образцом. Интенсивность возникающей затухающей волны спадает экспоненциально, и возбуждаются только структуры дна, находящиеся в непосредственной близости от границы раздела на расстоянии до нескольких сотен нанометров. Теперь мы продемонстрируем, как вручную сфокусировать лазерный луч в задней фокальной плоскости объектива.

При использовании системы из двух или трех линз первые две линзы служат для увеличения диаметра лазерного луча. Отношение их фокусных расстояний определяет размер пятна освещения в плоскости образца. Чтобы луч оставался коллимированным, отрегулируйте расстояние между этими линзами так, чтобы оно было равно сумме их фокусных расстояний.

Третья линза используется для фокусировки расширенного пучка в задней фокальной плоскости объектива. Поскольку фокусное расстояние этой линзы должно соответствовать габаритам корпуса микроскопа и связанного с ним перископа, в нашем случае оно должно быть значительно больше, примерно 75 сантиметров. Расстояние между второй и третьей линзами не влияет на характеристики пучка.

Следовательно, бесконечное пространство между ними можно использовать для модификации пучка определенным образом без возникновения искажений. Например, можно вставить апертуру и осуществить точную проекцию на плоскость образца. По сути, того же результата можно достичь, используя две линзы вместо трех.

Двухобъективная система менее определена, но вносит меньше аберраций линз. Простые элементы, такие как апертура, все еще могут быть эффективно реализованы для временной модуляции. Газовый, железный или твердотельный лазер должен быть расположен перед затвором миллисекундного диапазона, например, механическим затвором или оптическим модулятором.

Хорошей альтернативой является диодный лазер, который может быть модулирован электронно и не требует внешнего затвора. Для направления луча в любую точку и в любом направлении достаточно двух зеркал. Как обсуждалось ранее, две линзы используются для расширения пучка и его фокусировки на задней фокальной плоскости объектива микроскопа.

Мы можем перемещать луч для конфигурации «турф» (turf), сдвигая нижнее зеркало перископа по оптической направляющей. Для регистрации изображения мы используем высокочувствительную камеру, например, ПЗС-детектор с электронным умножением или em CCD. Второй лазерный луч другой длины волны может быть совмещен с траекторией основного луча.

С использованием зеркал и дихроичного фильтра. Для одновременной двухцветной детекции мы устанавливаем в путь эмиссии имеющееся в продаже устройство разделения луча. Для проведения экспериментов очень полезно иметь два независимых пути возбуждающего луча.

Например, один для получения снимков всей поверхности (turf imaging), а второй — для направленного фотообесцвечивания или активации. Этого можно легко добиться, используя набор из двух светоделителей 50/50. Как показано на нашей иллюстрации, две разные системы регулировки линз и зеркал обеспечат формирование двух отдельных профилей и углов луча.

Например, расширенная апертура для получения изображений в зоне turf и более сфокусированная для обесцвечивания или активации в зоне non turf. В луч non turf можно установить диафрагму для точного формирования пятна обесцвечивания или активации. Два дополнительных затвора, по одному для каждого пути луча, обеспечивают независимое управление переключением лазерного луча, при этом объектив остается на прямой ненаклоненной траектории.

Включите измеритель мощности и настройте его на соответствующую длину волны лазера. Измерьте мощность лазерного излучения на объективе и запишите полученное значение. Теперь переместите зеркало за микроскопом, чтобы направить лазерный луч на объектив в положение «торф».

Никогда не смотрите прямо на лазерный луч. В правом нижнем углу показан профиль интенсивности возбуждающего лазера, визуализированный через эмиссию бислоя, декорированного флуоресцентными белками. Здесь используется ложное цветовое представление для выделения областей с различной интенсивностью.

Измерьте среднюю интенсивность фона в достаточно большой области интереса. Это значение зависит от конкретных настроек камеры, таких как усиление EM и скорость считывания, и должно быть вычтено из всех измеренных интенсивностей. Определите среднюю интенсивность во всей освещенной области.

Выберите диаметр достаточного размера, чтобы значения интенсивности на периферии были близки к показателям фона камеры; измерьте среднюю интенсивность центральной области. Эта область определяет интересующую зону, в которой впоследствии будут проводиться микроскопические эксперименты. Теперь вычтите среднее значение интенсивности фона из интенсивности как удаленной, так и центральной областей.

Затем умножьте интенсивности с поправкой на фон на соответствующее количество пикселей в области, чтобы получить интегральные интенсивности. Примите интегральную интенсивность освещенной области за единицу и рассчитайте долю для центральной области. Мощность измеряют с помощью измерителя мощности.

В нашем случае пять милливатт прямо пропорциональны интегральной интенсивности всей освещенной области. Умножьте это значение на долю мощности центральной области, чтобы определить мощность внутри центральной области. В нашем примере она составляет 1,15 милливатт; коэффициент пересчета количества пикселей в квадратные микроны зависит от фактического размера пикселя матрицы камеры и увеличения тракта эмиссии.

Это можно легко определить с помощью предметного стекла с микрометрической шкалой. В нашем примере центральная область составляет 170.8 square microns. Плотность мощности представляет собой измеренную мощность, деленную на площадь, и thus равна 1.15 milliwatt, деленным на 170.8 square microns, или 0.007 milliwatt per square micron.

Это составляет 0,7 кВт на квадратный сантиметр. Для определения текучести бислоя мы проводим эксперимент по восстановлению флуоресценции после фотообесцвечивания. Как показано на видео в левом нижнем углу, мы получаем изображение флуоресцентного бислоя при низкой плотности мощности.

На видео в нижнем правом углу видна соответствующая камера лабораторного технического оборудования под микроскопом. Затем мы подвергаем круговую область выжиганию с помощью коротких импульсов высокой плотности мощности и контролируем восстановление при низкой плотности мощности. Снова монтаж обеспечивает обзор эксперимента для различных временных точек, где нулевое время соответствует импульсам выжигания.

Мы количественно определяем среднюю интенсивность флуоресценции с поправкой на фон внутри отмеченного круга и нормируем все измеренные значения интенсивности относительно интенсивности в начале эксперимента. До импульсов выжигания мы строим график зависимости нормированных значений интенсивности от времени. Значение насыщения в нашем случае представляет собой мобильную фракцию, которая составляет более 90%. Сначала сделайте снимок бислоя при низкой плотности мощности возбуждения.

Например, при использовании фильтра оптической плотности с логарифмическим значением ослабления, равным двум, мощность снижается в 100 раз. Время экспозиции должно оставаться постоянным на протяжении всей процедуры и быть достаточным для визуализации единичного силового потока жидкости при неаттенуированной плотности мощности, что в нашем случае составляет 10 миллисекунд при 0,7 киловатт на квадратный сантиметр. Используйте псевдоцветовую репрезентацию для выделения областей с разной интенсивностью.

Выберите один интересующий участок, на котором позже будут проведены измерения одиночных молекул, и один контрольный участок такого же размера. Для вычитания фона рассчитайте интегрированную интенсивность с вычитанием фона. Затем уберите фильтр оптической плотности из пути возбуждающего луча, обесцветьте область и сделайте снимок.

Вы увидите отдельные диффундирующие частицы флуорофора в обесцвеченной области. Одиночные флуорофоры ограничены дифракционным пределом с типичным диаметром от двух до трех пикселей; возьмите одну область размером семь на семь пикселей вокруг сигнала каждой отдельной молекулы и вторую область рядом с ней. Для вычитания фона важно количественно определить сигнал только одиночных флуорофоров.

Следовательно, лучше всего визуализировать белки на слое BI при соотношении [чего-либо] к белку менее одного или для белков, специфически помеченных SAT. Даже при соотношении одного к одному, как показано в нашем примере, измеряют интегральную интенсивность для обеих областей и вычитают фон из сигнала; при этом последнее наблюдаемое событие, показанное в нашем примере, не учитывают, так как во время усреднения экспозиции, вероятно, произошло выцветание. Здесь мы корректируем сигналы для одного из четырех флуоресцентных каналов, которые мы наблюдаем на протяжении девяти кадров.

Тем не менее, эту процедуру следует проводить как минимум для нескольких сотен событий одиночных молекул. Вернемся к исходному изображению бислоя, полученному при ослабленной плотности мощности возбуждения. Молекулярная плотность определяется путем корректировки интегрированной интенсивности интересующей области при низкой плотности мощности возбуждения путем умножения на сто и последующего деления на среднюю интенсивность одиночной молекулы и площадь.

Мы имеем дело с плотностью 421,4 флуоресцентных единиц на квадратный микрон. В нашем примере, при соотношении диетида к белку, равном единице, это соответствует такому же количеству молекул на квадратный микрон. После просмотра этого видео вы сможете подготовить и охарактеризовать функционализированный белком липидный бислой с помощью флуоресцентной микроскопии единичных молекул.

Кроме того, вам следует ознакомиться с базовыми принципами модификации и модернизации стандартного микроскопа для этой цели. В дальнейшем мы будем использовать данную методологию для определения кинетики связывания антигена, связанного с бислоем, с Т-клеточными рецепторами на поверхности клеток, однако многие другие приложения на этой основе, безусловно, возможны.