Одной молекулы флуоресцентной микроскопии на Planar Поддерживаемые Бислои

В этом видео мы покажем, как получить и охарактеризовать биофункционализированный планарный липидный билар. Мы также подробно опишем архитектуру микроскопа с полным внутренним отражением и возможностями детектирования отдельных молекул. Мы измерим плотность мощности возбуждения, текучесть и плотность белка липидного слоя.

Начнем с краткого введения: В плоскостное стекло с липидной поддержкой. Когда маленькие одноканарные везикулы сталкиваются с чистой стеклянной поверхностью, они лопаются и распространяются, образуя непрерывный липидный бислой. Для водной подушки мы обычно выбираем материал ладони.

Олефосфохолин или POPC имеет преобладающий липид, потому что он дает образование жидких липидных бислоев при комнатной температуре и 37 градусах Цельсия. Для функционализации мы добавляем никель антиокс, синтетический липид с хелатирующей группой никеля, который связывает белки полигистаминовых меток. Например, ко-стимулирующая молекула B 7 one, молекула адгезии ICAM one и флуоресцентно меченная пептидная молекула MHC для распознавания Т-клеток, как показано здесь, тем не менее, эта двухслойная система в принципе может быть использована для управления совершенно различными процессами в различных биологических системах.

Из-за природы планарной системы, флуоресцентные события можно контролировать в режиме полного внутреннего отражения, что значительно снижает клеточный фон и очень хорошо подходит для флуоресцентной микроскопии с одной молекулой. После обработки высоким вакуумом в течение ночи липиды образуют пленку на внутренней стороне колбы. Для регидратации липидов используйте Degas PBS в дозе 10 миллилитров Degas PBS на высушенную смесь липидов.

Не перемешивайте. Теперь, чтобы избежать окисления липидов, наполните колбу инертным газом, таким как азот или аргон. Липиды образуют молочную суспензию.

Возьмите небольшой образец в качестве заготовки для спектрофотометра, чтобы предотвратить газообмен на следующем этапе. Очень важно правильно укупорить колбу, содержащую липидную суспензию. Используйте термоустойчивую липкую ленту, например, автоклавную ленту там, где защита воздуха при физическом образовании осуществляется с помощью закрытой ультразвуковой ванны.

После установки колбы приступайте к процедуре ультразвуковой обработки на максимальной мощности 170 Вт. Sonic Cade в течение 60 минут. Из-за физического формирования, помутнение значительно снизилось.

Это можно проверить с помощью спектрофотометрии на 550 нанометрах. Используйте аликвоту, взятую перед обработкой ультразвуком, в качестве заготовки. Оптическая плотность на уровне 230 нанометров, которая указывает на количество липидов, должна оставаться постоянной.

Здесь мы заполняем небольшие ультрацентрифужные пробирки суспензией visl объемом в один миллилитр и помещаем их в ротор настольной ультрацентрифуги с фиксированным углом. Очень важно использовать только небольшие пузырьки uni laina для приготовления бислоя. Более крупные и плотные многослойные пузырьки, которые также образуются во время ультразвуковой обработки, препятствуют текучести бислоя и поэтому должны быть бледнеют и удаляются центрифугированием.

Сначала мы вращаем в течение часа при 150 000 G при комнатной температуре. Полученный снат затем центрифугируют в течение дополнительных восьми часов при температуре 288 000 G при четырех градусах Цельсия. Стеклянные лампы должны быть очень чистыми, прежде чем липидные пузырьки смогут распространяться на них, образуя непрерывный и жидкий бислой.

Для этого мы помещаем покровные листы в тефлоновую насыпь, которую затем помещаем в стеклянный сосуд для упражнения. Большая осторожность там, где защита глаз, защитные перчатки и лабораторный халат и работа в химическом шкафу. Мы добавляем одну часть 30% перекиси водорода, а затем три части концентрированной серной кислоты, чтобы получить очень реактивную и окислительную периомоносерную кислоту.

Эта смесь бурно реагирует с органическими веществами, в том числе с веществами кожи, глаз и одежды. Он нагревается сразу. Инкубируйте предметные стекла в течение 30 минут.

Захватите защитное стекло щипцом Тщательно смойте кислоту с обеих сторон чистого защитного стекла с помощью дистиллированной или высококачественной смешанной воды. Затем поместите предметное стекло на тефлоновую подставку и дайте ему высохнуть не более 10 минут, чтобы иметь возможность производить несколько отдельных липидных бислоев одновременно. Склеиваем высушенные покровные листы с быстрым затвердеванием.

Двухкомпонентный эпоксидный клей к восьмилуночной или 16-луночной лабораторной технической камере. Во-первых, осторожно снимите оригинальное стекло с его рамы. Смешайте два компонента клея в пропорции один к одному.

Равномерно распределите его по нижним пазам рамки камеры. Поместите чистую крышку на покрытую клеем дно рамки камеры. Убедитесь, что клей равномерно распределен между предметным стеклом и пластиковой рамкой.

Дайте клею застыть в течение 30 минут. Разбавляют физическую липидную суспензию в PBS от одного до 10 и фильтруют ее через фильтр 0,2 микрона из расчета 120 микролитров этого разбавления в каждую лунку камеры с восемью лунками или по 60 микролитров в каждую лунку камеры с 16 лунками. Убедитесь, что вся стеклянная поверхность покрыта, и подождите 20 минут.

Теперь бислой сформировался Чтобы избавиться от остатков леса, промойте каждую лунку 30 миллилитрами PBS. Любой ценой избегайте воздействия воздуха на поверхность стекла. Это мгновенно разрушит бислой, чтобы гарантировать, что каждая лунка содержит одинаковый объем буфера Для следующего этапа украшения белка полностью заполните каждую лунку и удалите купол жидкости.

Вынимаем 330 микролитров. Это оставит около 350 микролитров в каждом. Хорошо чтобы украсить бислой белками, приготовьте мастер-смесь, содержащую полигистаминовые технологические белки по выбору и добавьте 50 микролитров ее в каждую лунку.

Белки связываются с никелево-антиголовочной группой темного липида для обеспечения воспроизводимых результатов, тщательно перемешиваются и всегда инкубируются в течение 60 минут для удаления несвязанных белков. Снова умойтесь 30 миллилитрами PBS. Теперь давайте сосредоточимся на аппаратном обеспечении для микроскопии.

Во-первых, мы проиллюстрируем требования микроскопии полного внутреннего отражения для объективной микроскопии газона. Нужен масляный иммерсионный объектив с высокой числовой апертурой. Входящий луч лазерного возбуждения отражается дихроичным зеркалом и фокусируется с помощью набора из двух или трех линз только на заднюю фокальную плоскость объектива.

Затем лазерный свет направляет объектив в виде покрытого лучом вдоль оптической оси. Таким образом, флуоресцентный образец освещается на всю глубину. При перемещении луча перпендикулярно оптической оси луч остается собранным, но отклоняется от объектива под наклоном.

Если вы продолжите перемещение, то в какой-то момент достигнете критического угла, под которым луч полностью отражается на границе раздела между стеклопакетом и образцом. Интенсивность возникающей затухающей волны экспоненциально затухает, и возбуждаются только четвертые этажи, находящиеся в непосредственной близости от границы раздела с точностью до нескольких сотен нанометров. Теперь мы проиллюстрируем, как вручную сфокусировать лазерный луч в задней фокальной плоскости объектива.

При использовании трех или двух линз с первыми двумя линзами диаметр лазерного луча увеличивается. Отношение их фокусного расстояния определяет размер пятна освещения в плоскости образца. Чтобы луч оставался ровным, отрегулируйте расстояние между этими линзами так, чтобы оно было равно сумме фокусных расстояний обоих.

Третья линза используется для фокусировки расширенного луча в заднюю фокальную плоскость объектива. Поскольку фокусное расстояние этого объектива должно соответствовать размерам корпуса микроскопа и связанного с ним перископа, в нашем случае оно должно быть намного длиннее — 75 сантиметров. Расстояние между второй и третьей линзой не влияет на свойства луча.

Таким образом, пространство бесконечности между ними может быть использовано для изменения луча определенным образом без искажений. Например, можно вставить отверстие и точно спроецировать его на плоскость образца. По сути, того же можно добиться при использовании двух линз вместо трех.

Система из двух линз менее определена, но приводит к меньшему количеству аберраций объектива. Простые функции, такие как апертура Все еще могут быть очень хорошо реализованы для временной модуляции. Газовый, железный или твердотельный лазер должен быть размещен перед затвором миллисекундного диапазона, например, механическим затвором или алюминиевым оптическим модулятором.

Хорошей альтернативой является диодный лазер, который может быть электронно модулирован и не нуждается во внешней заглушке. Двух зеркал достаточно, чтобы направить луч в любое место и в любом направлении. Как обсуждалось ранее, эти две линзы используются для расширения луча и его фокусировки на задней фокальной плоскости микроскопа. Объективный.

Мы можем переместить луч для конфигурации газона, сместив нижнее зеркало перископа на оптической рейке. Для обнаружения изображений мы используем высокочувствительную камеру. Например, устройство с умножительной зарядовой связью электронов или второй лазерный луч em CCDA с другой длиной волны может быть выровнен по траектории луча.

С использованием зеркал и дихроичной накладки. Для одновременного обнаружения двух цветов мы размещаем коммерчески доступное устройство для разделения луча в тракте излучения. Для экспериментов очень полезно иметь два независимых пути пучка возбуждения.

Например, один для визуализации газона, а второй для целенаправленного фотообесцвечивания или активации. Этого можно легко достичь, установив комплект из 2 светоделителей 50 50. Как показано на нашем рисунке, две разные системы регулировки линз и зеркал приведут к созданию двух отдельных профилей луча и углов луча.

Например, расширенный для визуализации на газоне и более узкий для отбеливания или активации на негазоне. В луч без газона может быть размещено отверстие для точной формы точки отбеливания или активации. Две дополнительные заслонки, по одной на каждый путь луча Обеспечивают независимое управление переключателем лазерного луча, оставляя объектив на прямой ненаклонной траектории.

Включите измеритель мощности и настройте его на соответствующую длину волны лазера. Измерьте мощность лазерного излучения на объективе и запишите ее. Теперь переместите зеркало за микроскопом, чтобы наклонить лазерный луч на объектив в положение газона.

Никогда не смотрите прямо в свет лазера. В правом нижнем углу вы видите профиль интенсивности возбуждающего лазера, визуализированный через излучение бислоя, украшенного флуоресцентными белками. Здесь мы используем представление ложных цветов для выделения областей разной интенсивности.

Измерьте среднюю интенсивность фона в пределах достаточно большой области интереса. Это значение зависит от конкретных настроек камеры, таких как усиление ЭМ и скорость считывания, и его необходимо вычесть из всех измеренных интенсивностей. Определите среднюю интенсивность в пределах всей освещаемой площади.

Выберите диаметр достаточно большим, чтобы значения интенсивности на периферии были аналогичны значениям интенсивности фона камеры, измеряющей среднюю интенсивность центральной области. Эта область определяет область интереса, в которой в дальнейшем будут проводиться микроскопические эксперименты. Теперь вычтем среднее значение интенсивности фона из интенсивностей как удаленной, так и центральной области.

Затем умножьте скорректированные интенсивности фона на соответствующее количество пикселей размера области, чтобы получить интегрированные интенсивности. Установите интегральную интенсивность освещенной области равной единице и рассчитайте дробь для центральной области. Мощность, измеренная с помощью измерителя мощности.

В нашем случае пять милливатт прямо пропорциональны интегральной интенсивности всей освещаемой площади. Умножьте это значение на долю мощности центральной области, чтобы определить мощность в центральной области. В нашем примере, 1,15 милливатт, коэффициент преобразования количества пикселей в квадратные микроны зависит от фактического размера пикселя чипа камеры и увеличения пути излучения.

Его можно легко определить с помощью предметного стекла с помощью микрометра. В нашем примере центральная площадь соответствует 170,8 квадратным микронам. Плотность мощности относится к измеренной мощности, деленной на площадь, и, таким образом, равна 1,15 милливатт, деленной на 170,8 квадратных микрона, или 0,007 милливатт на квадратный микрон.

То есть 0,7 киловатта на квадратный сантиметр. Чтобы определить текучесть бислоя, мы проводим флуоресцентное восстановление после фотообесцвечивания обертывания. Как показано на нижнем левом видео, мы видим флуоресцентный бислой с низкой плотностью мощности.

В правом нижнем углу фильма вы можете увидеть соответствующую лабораторную техническую камеру на микроскопе. Затем мы отбеливаем круглую область короткими импульсами с высокой плотностью мощности и контролируем восстановление при низкой плотности мощности. Опять же, монтаж дает представление об эксперименте для различных временных точек, где нулевое время — это импульсы отбеливателя.

Мы количественно определяем среднюю скорректированную интенсивность флуоресценции фона в пределах круга отметки и нормализуем все измеренные интенсивности до интенсивности в начале эксперимента. Перед импульсами отбеливателя мы строим график нормализованных значений интенсивности в зависимости от времени. Значение насыщения представляет собой подвижную фракцию в нашем случае более 90%Сначала сделайте изображение бислоя при низкой плотности мощности возбуждения.

Например, при размещении фильтра оптической плотности со значением логарифмического затухания два, это снижает мощность в 100 раз. Время экспозиции должно быть постоянным на протяжении всей процедуры и достаточным для того, чтобы визуализировать единичную силу жидкости при неослабленной плотности мощности в нашем случае 10 миллисекунд при 0,7 киловатта на квадратный сантиметр. Используйте представление в ложных цветах, чтобы выделить области разной интенсивности.

Выберите одну область интереса, в которой впоследствии будут выполнены измерения одной молекулы, и одну область того же размера. Для вычитания фона вычислите интенсивность вычитания фона. Теперь снимите фильтр оптической плотности с пути луча возбуждения, обесцвечьте область и сделайте снимок.

Вы увидите, как отдельные силы гриппа рассеиваются в отбеленной области. Одиночные силы гриппа ограничены дифракцией с типичным диаметром от двух до трех пикселей, берут одну область семь на семь пикселей вокруг каждой отдельной молекулы сигнала и вторую область рядом. Для вычитания фона важно количественно оценить сигнал только одной силы Fluor

Таким образом, лучше всего визуализировать белки на слое BI с соотношением белка к белку менее единицы или для белков, специально меченных SAT. Еще большее соотношение рациона и белка единицы, как показано в нашем примере, измерьте интегральную интенсивность для обеих областей и вычтите фон из сигнала, чтобы не учитывать последнее наблюдаемое событие, показанное в нашем примере, поскольку обесцвечивание, вероятно, произошло во время среднего воздействия. Скорректированные сигналы здесь мы делаем для одного гриппа из четырех, который мы наблюдаем на протяжении девяти кадров.

Тем не менее, эту процедуру следует выполнять, по крайней мере, для нескольких сотен событий с одной молекулой. Давайте вернемся к нашему исходному изображению бислоя, наблюдаемому при ослабленной плотности мощности возбуждения. Молекулярная плотность определяется путем коррекции интегральной интенсивности интересующей области для низкой плотности мощности возбуждения путем умножения на сотню и деления ее на среднюю интенсивность отдельной молекулы и площадь.

Мы имеем дело с плотностью 421,4 силы флуория на квадратный микрон. В нашем примере при соотношении диеты к белку равным единице, это равно тому же количеству молекул на квадратный микрон. После просмотра этого видео вы сможете получить и охарактеризовать функционализированный белок липидный бислой с помощью флуоресцентной микроскопии с одной молекулой.

Кроме того, вы должны быть ознакомлены с основными принципами модификации и модернизации стандартного микроскопа для этой цели. Позже мы будем использовать эту методологию для определения кинетики связывания двухслойного связанного антигена с клеточными Т-клеточными рецепторами, но многие другие приложения, основанные на этом, безусловно, возможны.