Анализ функции бета клеток с использованием одной ячейки резолюции кальция визуализации в Zebrafish островков

Этот метод может помочь разобраться в важных вопросах в области бета-клеток. Например, функция гетерогена IT среди отдельных бета-клеток в островке. Основным преимуществом этого метода является пространственное и временное разрешение, обеспечиваемое визуализацией бета-клеток в реальном времени.

Мы можем зафиксировать колебания кальция в отдельных бета-клетках. После усыпления рыбы согласно текстовому протоколу переложите ее в чашку Петри, содержащую раствор HBSS с кальцием и магнием. Затем под стереомикроскопом, оснащенным флуоресцентной лампой и красным фильтрующим кубиком, с помощью острых щипцов разрезают кожу от рта до анального плавника.

Снимите порез с правой стороны, чтобы обнажить живот, который обнажит внутренние органы. Затем, используя красную флуоресценцию для идентификации экспрессии mKO2 в бета-клетках, найти островки. Очистите первичный островок, осторожно удалив окружающие ткани, такие как печень и адипоциты.

Примите меры предосторожности, чтобы не поранить и не проткнуть островок. Затем нанесите пипеткой каплю HBSS объемом 30 микролитров на центр чашки со стеклянным дном. Затем переложите рассеченный островок в каплю.

С помощью HBSS тщательно промойте островок один раз, затем используйте 30 микролитров рабочего раствора фибриногена, чтобы промыть его один раз. Избегайте высыхания островка на этапах промывки, что может привести к гибели клеток. Медленно и аккуратно добавьте в островок 10 микролитров 10 единиц на миллилитр раствора тромбина.

Оставьте островок и блюдо нетронутыми на 15-20 минут. Обратите внимание, что капля фибриногена тромбина станет вязкой и стабильной. Необходимо дать достаточное время для того, чтобы тромбин полимеризовался в растворе фибриногена.

В противном случае пресс-форма не обеспечит стабильность во время сеанса визуализации. Чтобы провести визуализацию флуоресценции GCaMP ex vivo в реальном времени, добавьте 200 микролитров HBSS в верхнюю часть формы и осторожно поместите чашку на держатель пластины конфокального микроскопа. Затем с помощью объектива с погрешностью 20X 0.8 NA и опции яркого поля найдите островок.

Использование фильтра для красной флуоресценции для просмотра флуоресценции ядерного mKO2 в бета-клетках фокусируется на островке. Отдельные ядра должны быть хорошо видны. Найдите четкую плоскость изображения, вручную перемещая островок по толщине его оси Z.

Убедитесь, что плоскость визуализации содержит от 50 до 100 бета-клеток для визуализации, а яркость флуоресценции ядерного mKO2 равномерна, особенно в центре островка. Затем в меню интеллектуальной настройки настройте последовательный сбор данных для флуоресценции GCaMP6 и mKO2 с использованием следующих настроек. Для GCaMP6 выберите возбуждение 488 нанометров и приблизительное излучение от 500 до 555 нанометров.

В поле «Ложный цвет» выберите GFP. Для mKO2 выберите возбуждение 561 нм и излучение от 570 до 630 нм. Для ложного цвета выберите mCherry.

В режиме съемки установите разрешение изображения на 1,024 на 1,024 пикселя, скорость на 10 и усреднение на единицу. Чтобы начать непрерывную запись, выберите параметр «Временные ряды» и установите продолжительность 500 циклов с примерно двумя секундами захвата на кадр. Следите за циклом визуализации.

После первых 50 кадров, не нарушая получение изображения, аккуратно нанесите пипеткой пять микролитров 200 миллимолярного раствора D-глюкозы поверх геля, удерживающего островок. Затем приобретают 150 кадров при 10 миллимолярных глюкозах. Первые 50 кадров временного ряда соответствуют активности бета-клеток при пяти миллимолярах глюкозы.

Это и есть базальная активность. Реагирующая бета-клетка со временем будет демонстрировать увеличение и уменьшение зеленой флуоресценции. На 200 кадрах увеличьте концентрацию глюкозы до 20 миллимоляров, осторожно добавив 10 микролитров 200 миллимолярной D-глюкозы.

Затем приобретают 150 кадров при концентрации 20 миллимоляров. Чтобы открыть файл изображения в FIJI, выберите Плагин, LSM Toolbox, показать LSM Toolbox. На панели инструментов LSM нажмите кнопку Открыть LSM и выберите файл изображения.

В разделе «Инструменты» в меню «Анализ» откройте «Менеджер ROI». С помощью инструмента выделения полигона, расположенного на панели инструментов, вручную нарисуйте ROI. Нарисуйте ROI в красном канале так, чтобы он охватывал область, превышающую ядро, и включал в себя часть цитоплазмы клетки.

Убедитесь, что положение ROI одинаково между кадрами, и при необходимости отрегулируйте положение. Добавьте выбранные ROI в менеджер ROI, нажав на кнопку «Добавить». Выберите и добавьте несколько ROI, чтобы получить данные по нескольким ячейкам.

Затем в меню «Анализ» выберите «Задать измерения». Затем выберите Интегрированная плотность для указания выделения общей интенсивности флуоресценции в области. Перейдите к зеленому каналу, содержащему флуоресценцию GCaMP, и в менеджере ROI выберите Multi Measure.

Это позволит измерить интенсивность ячеек на протяжении всего временного ряда. Сохраните вывод FIJI в виде текстового файла, разделенного запятыми. В наборе инструментов LSM получите временные метки кадров изображения.

Используйте команды Применить штампы, Применить t-штампы, Имя файла, Выгрузить в текстовый файл, чтобы получить временные метки. Сохраните временные метки с помощью опции «Сохранить как» или скопируйте их в таблицу. После составления значений интенсивности для всех клеток выполняйте анализ по одной ячейке за раз или автоматически.

Обратитесь к текстовому протоколу для получения дополнительной информации. В этом эксперименте отдельные первичные островковые бета-клетки из трансгенной линии 45 DPF, экспрессирующих ядерные mKO2 и GCaMP6 специфически в бета-клетках, стимулировали с помощью нарастания глюкозы, а затем деполяризовали хлоридом калия. Анализировали активность клеток.

С помощью программного обеспечения FIJI и анализа данных была выделена и нормализована интенсивность флуоресценции GCaMP6 отдельных бета-клеток. Как видно из этого следа интенсивности флуоресценции, отдельные бета-клетки демонстрируют колебания флуоресценции GCaMP6 при стимуляции глюкозой, а добавление хлорида калия стабилизирует флуоресценцию. Этот метод обеспечивает клеточное разрешение чувствительности бета-клеток к глюкозе и позволяет заглянуть в их функциональные возможности.

После освоения этой техники ее можно выполнить за 45 минут, если все сделано правильно. При выполнении этой процедуры важно проверить жизнеспособность бета-клеток. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как генетические манипуляции, чтобы понять роль конкретных генов в функционировании бета-клеток.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как измерять реакцию глюкозы в отдельных бета-клетках.