Выделение и проточной цитометрии Характеристика мышиных лимфоцитах тонкого кишечника

Общая цель этой процедуры заключается в выделении популяций отдельных клеток из различных отделов тонкой кишки, которые впоследствии могут быть использованы для проточного цитометрического анализа или альтернативных средств характеризации. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы иммунологии слизистых оболочек, такие как влияние микробиоты на развитие иммунной системы кишечника. Основные преимущества этой методики заключаются в том, что они быстры, воспроизводимы и не требуют трудоемких перколлевых градиентов.

Чтобы начать эту процедуру, поместите мышь тыльной стороной вниз и опрыскайте брюшную полость 70-процентным этанолом, выполните лапаротомию путем последовательного разрезания кожи, а затем перитонеальной фасции вдоль вентральной средней линии от лобкового симфиза до мечевидного отростка, обнажив таким образом брюшную полость. Затем отделите тонкую кишку от желудка, пересекая пилорический сфинктер. Аккуратно удалите тонкую кишку из брюшины и удалите брыжеечный жир.

Чтобы полностью удалить тонкую кишку, сделайте второй надрез в илеоцекальном переходе. Поместите изолированную тонкую кишку в среду RPMI с температурой 4 градусов Цельсия, содержащую 10 процентов FBS, чтобы максимизировать жизнеспособность клеток. Аккуратно удалите большие куски жира с помощью изогнутых щипцов и соблюдайте осторожность, чтобы не разорвать саму кишечную ткань во время процесса.

Чтобы удалить содержимое кишечника, канюлируйте проксимальный конец тонкой кишки с помощью подающей иглы 18-го калибра, прикрепленной к шприцу, и осторожно промойте кишечник от 15 до 20 миллилитров холодной PBS. С помощью ножниц иссекайте пластыри Пейера, которые расположены на антиментерийной стороне тонкой кишки и выглядят как многодольчатое белое образование. Затем поместите их в холодную среду RPMI, содержащую пять процентов FBS.

Затем разрежьте тонкую кишку на трех-четырехдюймовые сегменты, удалите остаточный жир, раскатав каждый сегмент тонкой кишки на бумажном полотенце, смоченном RPMI, и используйте тупой скальпель, чтобы оторвать жир от ткани. Пристальное внимание к полному удалению брыжеечного жира имеет решающее значение для обеспечения жизнеспособности лимфоцитов, поскольку даже мельчайшие кусочки жира могут привести к гибели клеток. После этого выверните ткань наизнанку, канюлируя кишечные сегменты изогнутыми щипцами и захватывая дистальный конец ткани, затем с помощью пары прямых щипцов аккуратно удалите сегмент ткани с проксимального конца, в результате чего ткань будет перевернута.

Поместите сегменты ткани в чашку, содержащую 30 миллилитров среды для экстракции, и полосу для размешивания. Закройте крышкой крышку и помешивайте в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Помешивание должно быть энергичным, но не бурным.

Через 15 минут с помощью стального ситечка отделите кусочки ткани от эпителия, содержащего надосадочную жидкость, которая должна выглядеть мутной. Вручную перемешайте кусочки ткани в среде RPMI, чтобы смыть остатки экстракционной среды. Затем положите салфетку на сухое бумажное полотенце, и переверните его несколько раз, чтобы облегчить удаление остатков слизи, которые не были освобождены экстракционной средой.

Затем поместите фрагменты ткани в пятимиллилитровую пробирку объемом в одну точку с 600 микролитрами среды для пищеварения. Пропустите через мясорубку до тех пор, пока кусочки не перестанут прилипать к ножницам и раствор не покажется однородным. Этот шаг имеет решающее значение для обеспечения полного ферментативного переваривания тканей.

Измельчение ткани до тех пор, пока кусочки не перестанут прилипать к ножницам и раствор не станет однородным, имеет решающее значение для обеспечения клеточного выхода, а также для обеспечения воспроизводимости результатов. Добавьте измельченный тонкий кишечник в чашку, содержащую 25 миллилитров пищеварительной среды, и помешивайте в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. В середине процесса пищеварения проводите его вверх и вниз с помощью серологической пипетки, чтобы помочь расщепить любые большие куски ткани.

Далее отфильтруйте пищеварительную ткань через клеточное ситечко объемом 100 микрометров в пробирку объемом 15 миллилитров. Промойте ситечко 20 миллилитрами среды RPMI, содержащей 10 процентов FBS. После этого центрифугируйте отфильтрованный раствор в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия.

Осторожно сцедите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре среды RPMI, содержащей 10 процентов FBS. Отфильтруйте повторно суспензированные клетки через клеточное сетчатое фильтр 40 микрометров в пробирку объемом 15 миллилитров. Промойте ситечко 20 миллилитрами RPMI, содержащими 10 процентов FBS.

Впоследствии центрифугируйте отфильтрованный раствор в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Осторожно сцедите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре среды RPMI, содержащей два процента FBS. Во время этой процедуры переложите вырезанные пластыри Пейера в чашку с 25 миллилитрами пищеварительной среды и полосой для перемешивания.

Закройте крышку и отжимайте в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После этого отфильтруйте переваренные пластыри Пейера через клеточное ситечко 40 микрометров в пробирку объемом 15 миллилитров. Если какие-либо комочки остались, продавите их через ситечко с помощью плоского конца поршня от одномиллилитрового шприца.

Затем промойте ситечко 10 миллилитрами среды RPMI, содержащей 10 процентов FBS. Центрифугируйте отфильтрованный раствор в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Затем осторожно сцедите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре среды RPMI, содержащей два процента FBS.

Проточный цитометрический анализ одиночных клеточных суспензий лимфоцитов тонкого кишечника должен дать дискретную популяцию клеток, которые имеют схожие характеристики прямого и бокового рассеяния, что и спленоциты. Лимфоциты могут начать умирать, если ткань не поддерживается на уровне четырех градусов Цельсия на начальных стадиях выделения, в результате чего популяция лимфоцитов имеет более низкий прямой разброс и их труднее отделить от других эпителиальных и мертвых клеток. Более того, если брыжеечный жир не будет полностью удален из тканей тонкого кишечника, произойдет практически полная потеря лимфоцитов.

Как правило, достигается 80-процентная жизнеспособность лимфоцитов ЛП в тонком кишечнике. После освоения можно обработать четырех мышей и получить суспензии одиночных клеток, готовые к окрашиванию, менее чем за четыре часа. Во время этой процедуры важно полностью удалить весь брыжеечный жир и хорошо измельчить ткань, чтобы обеспечить полноценное пищеварение.

После этой процедуры суспензии одиночных клеток могут быть использованы для целей, отличных от проточной цитометрии, таких как эксперименты in vitro, анализ экспрессии генов или адоптивный перенос для дальнейшей характеристики функции этих клеток. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области иммунологии слизистых оболочек к изучению онтогенеза и функциональных последствий иммунной системы кишечника у мышей. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изолировать одноклеточные суспензии из разных отделов тонкого кишечника, очищая брыжеечный жир, извлекая эпителиальный слой и переваривая ткань с коллагеназой.