Использование вирусных входных анализов и молекулярного стыковочного анализа для выявления противовирусных кандидатов против Коксакивируса A16
15 июля 2019 г.
Цель протокола состоит в том, чтобы проиллюстрировать различные анализы, связанные с вирусной записи, которые могут быть использованы для выявления кандидатов вирусных ингибиторы входа.
Этот протокол может помочь в открытии потенциальных противовирусных малых молекул с помощью подхода, управляемого механизмом. Время дополнительного анализа определяет, на каком этапе инфекции небольшая молекула проявляет свою противовирусную активность. Молекулярная стыковка предсказывает взаимодействие между маленькой молекулой и вирусными белками.
Для оценки влияния наркотиков на клетки-хозяина до вирусной инфекции, семенные RD-клетки в 12-хорошо пластин в два раза от 10 до пятой клетки на плотность покрытия хорошо. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе двуокиси 5%углерода в одночасье. На следующее утро, лечить каждый колодец RD монослой с испытательным соединением интереса, в тройном, в нетоксичных концентрациях в одном миллилитре базальной среды в течение одного или четырех часов.
В конце инкубации лечения, мыть клетки с одним миллилитров PBS перед добавлением 50 бляшек формирования единиц вируса в 300 микролитров базальной среды на колодец в течение одного часа, с качания каждые 15 минут. В конце инкубации инфекции, мыть клетки с PBS и наложить клетки с одним миллилитр свежей базальной среды, содержащей 0,8%метилцеллюлозы. После 72 часов в инкубаторе культуры клетки, мыть каждый хорошо с двумя миллилитров PBS и исправить клетки с 0,5 миллилитров 37%формальдегида на колодец в течение 15 минут.
В конце фиксации, мыть скважины с PBS и пятно клеток с 0,5 миллилитров 0,5%кристалл фиолетовый раствор на скважину. Через две минуты промойте колодцы нежным потоком воды и дайте пластине высохнуть. Затем поместите пластину на белую световую коробку для подсчета и расчета процента коксакивируса инфицированных клеток в соответствии с формулой.
Для молекулярного стыковочного анализа загрузите 3D-молекулы тестовых соединений из PubChem. Если молекула не имеет загруженной 3D-структуры, загрузите 2D-структуру или используйте последовательность струн SMILE для преобразования структуры в 3D-молекулу с помощью соответствующей молекулярной программы. Далее загрузите вирусную биологическую сборочную единицу из RCSB Protein Data Bank.
Используя соответствующую программу био-вычислений, удалите растворители из файла Банка данных protein, замените неполные боковые цепочки, используя данные из библиотеки ротамеров Dunbrack 2010, и добавьте водород и заряды в структуру, как сообщалось ранее. Чтобы пристыковать тестовые соединения к подготовленному вирусному блоку, загрузите файл соединения теста в Калифорнийский университет Сан-Франциско Химера в качестве лиганда и выберите весь подготовленный вирусный белок в качестве рецептора для выполнения слепой стыковки. Для дополнительной стыковки ограничьь место стыковки вирусным белком в области, представляющие интерес, полученные в результате слепой стыковки, путем дальнейшего сокращения объема поиска.
Затем загрузите файл стыковки в соответствующую молекулярную графику для анализа позиций режима связывания. Выберите лиганд, чтобы найти полярные контакты от соединения до вирусного белка, идентифицирует полярные контакты с любым вариантом атомов. Обе небольшие молекулы, протестированные в этом репрезентативном эксперименте, только произвели незначительное воздействие против coxsackievirus A16 инфекционности, будь то в предварительной обработке клеток-хозяй до вирусной инфекции или в постинфекционом лечении.
В отличие от этого, молекулы эффективно отменены инфекции более чем на 80% в совместное дополнение лечения, предполагая, что два соединения являются наиболее эффективными, когда они одновременно присутствуют с частицами вируса на поверхности клетки-хозяина во время инфекции. Цитометрия потока на основе связывания анализа подтверждает, что два танина предотвратить coxsackievirus A16 инфекционное вступление путем предотвращения вирусных частиц связывания с клетками-хозяинами. Молекулярная стыковка танинов указывает на то, что они оба предсказал связывать в каньоне области coxsackievirus pentamer, чуть выше карманного входа, который держит карманный фактор и играет важную роль для посредничества coxsackievirus связывания и вступления в клетку-хозяина.
В этих поверхностных проекциях можно наблюдать уникальные остатки, предсказанные полярными контактами малых молекул вокруг карманного входа, с аспарагином-85, лизином-257 и аспарагином-417, общими между двумя танинами. Для молекулярной стыковки при ранжирование связывающих кадров необходимо учитывать топологию вирусного белка. Дополнительные эксперименты могут включать тестирование противовирусной активности соединения на рекомбинантных вирусах, с мутациями на аминокислотах, обнаруженных для подтверждения их важности для эффективности препарата.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данный протокол помогает в поиске потенциальных противовирусных малых молекул с использованием механистического подхода. В нем описаны различные анализы, связанные с проникновением вируса в клетку, для идентификации кандидатов в ингибиторы вирусного входа.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Вирусология
- Фармакология
- Клеточная биология
Теоретическая часть
- Понимание механизмов проникновения вируса в клетку имеет решающее значение для разработки противовирусной терапии.
- Малые молекулы могут ингибировать проникновение вируса на различных стадиях.
- Методы анализа позволяют выявить эффективные противовирусные соединения-кандидаты.
- Подходы, основанные на изучении механизмов действия, оптимизируют процесс поиска новых препаратов.
Цель исследования
- Продемонстрировать методы анализа для идентификации ингибиторов проникновения вирусов.
- Оценить противовирусную активность малых молекул.
- Создать основу для дальнейшего поиска противовирусных препаратов.
Используемые методы
- Анализ времени добавления для определения этапа инфекции, на который влияет малая молекула.
- Молекулярный докинг для прогнозирования взаимодействий между малыми молекулами и вирусными белками.
- Протоколы посева и обработки клеток линии RD.
- Оценка влияния препарата на клетки-хозяева до вирусного заражения.
Основные результаты
- Идентификация перспективных малых молекул с противовирусными свойствами.
- Представление о времени проявления противовирусной активности в ходе инфекции.
- Прогнозирование взаимодействий между малыми молекулами и вирусными белками.
- Оценка реакций клеток хозяина на противовирусную терапию.
Выводы
- Данный протокол представляет собой систематический подход к поиску противовирусных средств.
- С помощью этих анализов можно эффективно выявлять потенциальные ингибиторы проникновения вирусов.
- Результаты данной работы могут стать основой для будущих исследований по разработке лекарственных препаратов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Механистический поиск противовирусных препаратов требует точной идентификации соединений, блокирующих проникновение вируса, что является критической точкой на ранних стадиях инфекции. Данный протокол позволяет проводить валидацию мишени путем определения стадии противовирусной активности и прогнозирования молекулярных взаимодействий с вирусными белками. Такое снижение рисков способствует идентификации ведущих соединений и приоритизации портфеля при разработке линейки противовирусных препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтическую гипотезу, определяя, на каком этапе инфекции малые молекулы проявляют противовирусную активность с помощью анализа времени добавления препарата.
- Практическая ценность: Обеспечивает количественную оценку ингибирования инфекции для подтверждения мишени и снижения рисков, связанных с механизмом действия.
- Прогностическая ценность: Использует молекулярный докинг для предсказания сайтов связывания на белках вирусного капсида, что позволяет подтвердить мишень на уровне отдельных аминокислотных остатков.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Использование методов связывания на основе проточной цитометрии для количественного измерения прикрепления вирусных частиц к клеткам-хозяевам.
- Практическая ценность: Стандартизация процедур инактивации вирусов и анализов времени добавления для воспроизводимой оценки эффективности соединений в различных условиях.
- Масштабируемость: Подготовка валидированных биологических систем (клетки RD) для последующих этапов скрининга и повторного использования анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Связывает данные об ингибировании раннего проникновения с прогностической достоверностью противовирусной эффективности посредством подтверждения с помощью ортогональных анализов.
- Механистическое снижение рисков: Подтверждает взаимодействие с мишенью путем сопоставления остатков, предсказанных докингом (например, asparagine-85, lysine-257, asparagine-417), с функциональными данными о связывании.
- Релевантность доклинической модели: Использует релевантные заболеванию модели инфекции Coxsackievirus A16 для оценки активности ингибитора в физиологически значимой системе.
Интеграция в конвейер и рабочие процессы
Данный метод интегрируется в общий процесс поиска противовирусных средств — от ранней валидации мишени до идентификации соединений-лидеров, обеспечивая принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки на основе механистических и количественных данных.
- Открывательная биология: Поддерживает проверку гипотез, позволяя определить, действуют ли соединения путем ингибирования связывания вируса или через механизмы, работающие после проникновения в клетку.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированных протоколов измерения связывания вируса, его инактивации и определения времени добавления препаратов.
- Аналитика: Позволяет получать количественные зависимые переменные (процент ингибирования инфекции, прогнозы аффинности связывания) для сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: Связывает данные об ингибировании проникновения с доклиническими разработками путем подтверждения взаимодействия с целевыми участками в областях вирусного капсида.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для скрининга кандидатов в противовирусные препараты против других пикорнавирусов или неимеющих оболочки вирусов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет разграничения противовирусных эффектов, проявляющихся до прикрепления, в процессе связывания и после связывания.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость анализов в форматах определения времени добавления, связывания и инактивации.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) путем подтверждения взаимодействия с мишенью до начала ресурсозатратной оптимизации соединений-лидеров.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию соединений с учетом рисков на основе двойной валидации данными функциональных анализов и структурного докинга.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области вирусологии, культивирования клеток и использования программного обеспечения для молекулярного докинга (например, UCSF Chimera).
- Необходим доступ к инфраструктуре соответствующего уровня биологической безопасности для работы с вирусами и проведения анализа по методу бляшек.
- Требуется взаимная стандартизация между группами вирусологии и вычислительной биологии для согласованной интерпретации данных.
- При расширении области применения анализа на другие вирусные системы или клеточные линии, помимо клеток RD, необходимо учитывать особенности адаптации.
- Практическое ограничение: точность докинга зависит от качества структуры белка и подготовки лиганда, что требует подтверждения с помощью мутагенеза или анализов на связывание.
