Флуоресценция активированная сортировка клеток для изоляции популяций склеакттинских клеток
31 мая 2020 г.
Кораллы создают биоразнообразные экосистемы, важные как для человека, так и для морских организмов. Тем не менее, мы до сих пор не понимаем весь потенциал и функции многих коралловых клеток. Здесь мы представляем протокол, разработанный для изоляции, маркировки и разделения популяций каменистых коралловых клеток.
Этот протокол облегчает идентификацию и изоляцию популяций живых коралловых клеток на уровне описания, который ранее был не возможен. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет получить доступ к уровню клеточной специфичности, который до сих пор был в основном недостижим. Демонстрация процедуры будет д-р Шеннон Сай, научный сотрудник из потока цитометрии совместного ресурса в Сильвестр Всеобъемлющего онкологического центра.
Чтобы настроить цитометр потока для сортировки живых коралловых клеток, откройте новый шаблон проекта в программном обеспечении цитометра потока и выберите соответствующие лазеры для анализа в лазерной панели. Затем создайте боковой рассеяние по сравнению с участком рассеяния вперед в соответствующих участках для настройки стратегии гэтинга и анализа. Для цитометрического анализа потока и сортировки живых коралловых клеток загрузите контрольный образец неописуемой клетки в выборку цитометра и начните процесс чтения.
Поскольку коралловые клетки особенно хрупкие, держите давление цитометра на низком уровне, чтобы предотвратить лиз клеток. В участке рассеяния отрегулируйте напряжение мультипликатора фотографии, чтобы центрить точки и начните записывать события. В вперед против бокового рассеяния участок, создать ворота вокруг клеток примерно на 10 до 4-й отметки на вперед рассеяния x-оси.
Замените контрольный образец на первый образец окрашенных клеток и завемите около 10 000 клеток перед паузой. Затем ворота события, которые являются уникальными для окрашенных образец группы. Для сортировки живых коралловых клеток, после выбора клеточной популяции, заинтересованной в программном обеспечении цитометра потока, поместите одну микроцентрифугную трубку, содержащую от 250 до 500 микролитров соответствующего раствора сбора, в камеру сбора цитометров для каждой популяции.
После того, как соответствующее количество времени прошло, чтобы избавиться от мусора, начать сортировку желаемой популяции для сбора в любом месте от 10000 до нескольких миллионов клеток. Каждый раз, когда используется новое пятно, вид или сортер, сортируют не менее 20 000 клеток, представляющих интерес, в 500 микролитров окрашивания среды, чтобы проверка чистоты проводилась на население, представляющие интерес, и повторно окрашивали отсортированные клетки, чтобы подтвердить, что события читаются в воротах, используемых для первоначальной сортировки. Для исследований in vitro храните отсортированную клетку на льду до тех пор, пока они не будут переданы в инкубатор или стерилизованную среду.
Чтобы принести в других неклеточных частиц, которые не имеют той же формы или детализации, как коралловые клетки могут быть удалены из анализа, создавая выбор ворот на вперед и стороны рассеяния участка. Мертвые клетки могут быть исключены путем сравнения сигнала DAPI необлиссных и окрашенных клеточных суспензий с помощью гистограммы и выгоняя высокие daPI-выражают клетки. Параллельно клетки, принимающие симбиоденезию аутофторесценции, могут быть удалены путем приготовки к клеткам с высоким сигналом в дальнем красном канале.
После этого итеративного процесса gating, остальные клетки представляют неповрежденные популяции живых коралловых клеток, не имеющих симбиоденазии. Эти клетки могут быть классифицированы в различные субпопуляции клеток путем окрашивания для таких функций, как реактивной активности видов кислорода и / или лизосомы содержания. Очень важно помнить, что некоторые клетки являются более хрупкими, чем другие, и запустить этот процесс как можно тщательнее.
После того, как конкретные клетки были изолированы, они могут быть использованы для x-vivo функциональных анализов, таких как создание клеточных культур и создание транскриптомных профилей.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Это исследование направлено на необходимость лучшего понимания клеток кораллов, которые имеют решающее значение для биоразнообразия в морских экосистемах. Авторы представляют новый протокол для изоляции и маркировки популяций клеток коралловых полипов, достигая беспрецедентного уровня специфичности клеток.
Ключевые компоненты исследования
Область исследования
- Биология кораллов
- Техники изоляции клеток
- Биоразнообразие экосистем
Бакграунд
- Кораллы формируют важные экосистемы для морской жизни.
- Текущие знания о функциях клеток кораллов ограничены.
- Изоляция конкретных популяций клеток кораллов жизненно важна для дальнейших исследований.
Используемые методы
- Флоу-цитометрия для сортировки живых клеток
- Коралловые полипы в качестве модельного организма
- Стратегия формирования шлюзов для идентификации и изоляции конкретных типов клеток
Основные результаты
- Протокол позволяет идентифицировать и сортировать популяции живых клеток кораллов.
- Обеспечивает чистоту и жизнеспособность отсортировочных клеток для будущих анализов.
- Упрощает исследование субпопуляций и их функций.
Выводы
- Исследование представляет надежный метод изоляции клеток кораллов, улучшающий потенциал исследований.
- Результаты вносят важные знания в биологию кораллов и здоровье экосистем.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Isolating specific cell populations from complex tissues remains a critical challenge in early-stage target validation and mechanistic de-risking. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) enables high-resolution cellular interrogation, supporting predictive confidence in pathway-specific responses. This capability is directly applicable to biopharma discovery workflows requiring precise functional assays and transcriptomic profiling of rare or fragile cell types.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses at single-cell resolution by isolating live populations for functional validation.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by separating viable cell subpopulations from debris, dead cells, and symbiont-associated signals.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating purified inputs for downstream assays that clarify target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, viable cell suspensions suitable for reproducible functional assays and dose-response profiling.
- Operational Value: Establishes gating strategies that ensure assay readiness and minimize variability across experimental runs.
- Scalability: Allows collection of sufficient cell numbers (10,000 to several million) for multi-well screening and omics applications.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by enabling consistent isolation of disease-relevant cell populations for mechanistic follow-up.
- Biomarker Alignment: Facilitates staining for stress-response markers (e.g., reactive oxygen species, lysosome content) to correlate cellular phenotypes with functional outcomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Purified populations improve data reliability in preclinical models, reducing false positives from heterogeneous samples.
Pipeline & Workflow Integration
FACS integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by enabling precise cellular inputs at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating live coral (or analogous mammalian) cell populations for pathway-specific functional interrogation.
- Screening: Delivers standardized, gated cell populations that enhance assay reproducibility and quantitative readout reliability.
- Analytics: Generates high-purity samples enabling accurate transcriptomic, proteomic, or metabolic profiling to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation through consistent preparation of viable, stress-responsive cell subsets.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability across projects requiring subcellular resolution, independent of model system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing noise from non-target cells and enabling mechanistic de-risking of targets.
- Operational Value: Standardizes sample preparation through reproducible gating, low-pressure sorting, and viability-preserving collection methods.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing cleaner biological data, reducing late-stage failure risk from flawed target assumptions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through reliable subpopulation-specific data that informs advancement criteria.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry setup, including laser selection, voltage optimization, and scatter plot gating for fragile cells.
- Dependent on instrumentation capable of low-pressure sorting and multi-parameter detection (forward/side scatter, fluorescence channels).
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols, collection media, and gating thresholds to ensure reproducibility.
- Must account for variability in cell fragility across species or conditions, requiring iterative optimization of shear stress and staining duration.
- Limited by sample preparation quality; enzymatic or mechanical dissociation must preserve epitope integrity and cell viability for accurate sorting.
