Флуоресценция активированная сортировка клеток для изоляции популяций склеакттинских клеток
May 31st, 2020
Кораллы создают биоразнообразные экосистемы, важные как для человека, так и для морских организмов. Тем не менее, мы до сих пор не понимаем весь потенциал и функции многих коралловых клеток. Здесь мы представляем протокол, разработанный для изоляции, маркировки и разделения популяций каменистых коралловых клеток.
Этот протокол облегчает идентификацию и изоляцию популяций живых коралловых клеток на уровне описания, который ранее был не возможен. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет получить доступ к уровню клеточной специфичности, который до сих пор был в основном недостижим. Демонстрация процедуры будет д-р Шеннон Сай, научный сотрудник из потока цитометрии совместного ресурса в Сильвестр Всеобъемлющего онкологического центра.
Чтобы настроить цитометр потока для сортировки живых коралловых клеток, откройте новый шаблон проекта в программном обеспечении цитометра потока и выберите соответствующие лазеры для анализа в лазерной панели. Затем создайте боковой рассеяние по сравнению с участком рассеяния вперед в соответствующих участках для настройки стратегии гэтинга и анализа. Для цитометрического анализа потока и сортировки живых коралловых клеток загрузите контрольный образец неописуемой клетки в выборку цитометра и начните процесс чтения.
Поскольку коралловые клетки особенно хрупкие, держите давление цитометра на низком уровне, чтобы предотвратить лиз клеток. В участке рассеяния отрегулируйте напряжение мультипликатора фотографии, чтобы центрить точки и начните записывать события. В вперед против бокового рассеяния участок, создать ворота вокруг клеток примерно на 10 до 4-й отметки на вперед рассеяния x-оси.
Замените контрольный образец на первый образец окрашенных клеток и завемите около 10 000 клеток перед паузой. Затем ворота события, которые являются уникальными для окрашенных образец группы. Для сортировки живых коралловых клеток, после выбора клеточной популяции, заинтересованной в программном обеспечении цитометра потока, поместите одну микроцентрифугную трубку, содержащую от 250 до 500 микролитров соответствующего раствора сбора, в камеру сбора цитометров для каждой популяции.
После того, как соответствующее количество времени прошло, чтобы избавиться от мусора, начать сортировку желаемой популяции для сбора в любом месте от 10000 до нескольких миллионов клеток. Каждый раз, когда используется новое пятно, вид или сортер, сортируют не менее 20 000 клеток, представляющих интерес, в 500 микролитров окрашивания среды, чтобы проверка чистоты проводилась на население, представляющие интерес, и повторно окрашивали отсортированные клетки, чтобы подтвердить, что события читаются в воротах, используемых для первоначальной сортировки. Для исследований in vitro храните отсортированную клетку на льду до тех пор, пока они не будут переданы в инкубатор или стерилизованную среду.
Чтобы принести в других неклеточных частиц, которые не имеют той же формы или детализации, как коралловые клетки могут быть удалены из анализа, создавая выбор ворот на вперед и стороны рассеяния участка. Мертвые клетки могут быть исключены путем сравнения сигнала DAPI необлиссных и окрашенных клеточных суспензий с помощью гистограммы и выгоняя высокие daPI-выражают клетки. Параллельно клетки, принимающие симбиоденезию аутофторесценции, могут быть удалены путем приготовки к клеткам с высоким сигналом в дальнем красном канале.
После этого итеративного процесса gating, остальные клетки представляют неповрежденные популяции живых коралловых клеток, не имеющих симбиоденазии. Эти клетки могут быть классифицированы в различные субпопуляции клеток путем окрашивания для таких функций, как реактивной активности видов кислорода и / или лизосомы содержания. Очень важно помнить, что некоторые клетки являются более хрупкими, чем другие, и запустить этот процесс как можно тщательнее.
После того, как конкретные клетки были изолированы, они могут быть использованы для x-vivo функциональных анализов, таких как создание клеточных культур и создание транскриптомных профилей.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Это исследование направлено на необходимость лучшего понимания клеток кораллов, которые имеют решающее значение для биоразнообразия в морских экосистемах. Авторы представляют новый протокол для изоляции и маркировки популяций клеток коралловых полипов, достигая беспрецедентного уровня специфичности клеток.
Ключевые компоненты исследования
Область исследования
- Биология кораллов
- Техники изоляции клеток
- Биоразнообразие экосистем
Бакграунд
- Кораллы формируют важные экосистемы для морской жизни.
- Текущие знания о функциях клеток кораллов ограничены.
- Изоляция конкретных популяций клеток кораллов жизненно важна для дальнейших исследований.
Используемые методы
- Флоу-цитометрия для сортировки живых клеток
- Коралловые полипы в качестве модельного организма
- Стратегия формирования шлюзов для идентификации и изоляции конкретных типов клеток
Основные результаты
- Протокол позволяет идентифицировать и сортировать популяции живых клеток кораллов.
- Обеспечивает чистоту и жизнеспособность отсортировочных клеток для будущих анализов.
- Упрощает исследование субпопуляций и их функций.
Выводы
- Исследование представляет надежный метод изоляции клеток кораллов, улучшающий потенциал исследований.
- Результаты вносят важные знания в биологию кораллов и здоровье экосистем.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Isolating specific cell populations from complex tissues remains a critical challenge in early-stage target validation and mechanistic de-risking. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) enables high-resolution cellular interrogation, supporting predictive confidence in pathway-specific responses. This capability is directly applicable to biopharma discovery workflows requiring precise functional assays and transcriptomic profiling of rare or fragile cell types.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses at single-cell resolution by isolating live populations for functional validation.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by separating viable cell subpopulations from debris, dead cells, and symbiont-associated signals.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating purified inputs for downstream assays that clarify target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, viable cell suspensions suitable for reproducible functional assays and dose-response profiling.
- Operational Value: Establishes gating strategies that ensure assay readiness and minimize variability across experimental runs.
- Scalability: Allows collection of sufficient cell numbers (10,000 to several million) for multi-well screening and omics applications.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by enabling consistent isolation of disease-relevant cell populations for mechanistic follow-up.
- Biomarker Alignment: Facilitates staining for stress-response markers (e.g., reactive oxygen species, lysosome content) to correlate cellular phenotypes with functional outcomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Purified populations improve data reliability in preclinical models, reducing false positives from heterogeneous samples.
Pipeline & Workflow Integration
FACS integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by enabling precise cellular inputs at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating live coral (or analogous mammalian) cell populations for pathway-specific functional interrogation.
- Screening: Delivers standardized, gated cell populations that enhance assay reproducibility and quantitative readout reliability.
- Analytics: Generates high-purity samples enabling accurate transcriptomic, proteomic, or metabolic profiling to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation through consistent preparation of viable, stress-responsive cell subsets.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability across projects requiring subcellular resolution, independent of model system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing noise from non-target cells and enabling mechanistic de-risking of targets.
- Operational Value: Standardizes sample preparation through reproducible gating, low-pressure sorting, and viability-preserving collection methods.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing cleaner biological data, reducing late-stage failure risk from flawed target assumptions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through reliable subpopulation-specific data that informs advancement criteria.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry setup, including laser selection, voltage optimization, and scatter plot gating for fragile cells.
- Dependent on instrumentation capable of low-pressure sorting and multi-parameter detection (forward/side scatter, fluorescence channels).
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols, collection media, and gating thresholds to ensure reproducibility.
- Must account for variability in cell fragility across species or conditions, requiring iterative optimization of shear stress and staining duration.
- Limited by sample preparation quality; enzymatic or mechanical dissociation must preserve epitope integrity and cell viability for accurate sorting.
