Выделение человека эндотелиальных клеток лимфатической от нескольких параметров флуоресценции активирован сортировки клеток

Общая цель этой процедуры заключается в выделении лимфатических эндотелиальных клеток высокой чистоты, которые выстилают лимфатические сосуды лимфатических мальформаций и крайней плоти человека, с помощью сортировки флуоресцентных активированных клеток. Это достигается сначала путем ферментативного переваривания образца ткани пациента. На втором этапе одноклеточную суспензию культивируют для обогащения количества лимфатических эндотелиальных клеток.

В образце. Затем клетки помечают антителами к интересующим маркерам клеточной поверхности и сортируют с помощью многопараметрической флуоресцентной активированной сортировки клеток. В конечном счете, крайняя плоть и лимфатическая мальформация, лимфатические эндотелиальные клетки могут быть расширены в клеточной культуре для дальнейшего последующего анализа.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами заключается в том, что флуоресцентная активированная сортировка клеток дает клетки чистоты более 99%, что позволяет избежать проблем, связанных с потерей лимфатических эндотелиальных клеток из-за чрезмерного роста путем загрязнения клеток. Начните с взвешивания 50 миллилитровой трубки, содержащей 10 миллилитров среды, дополненной антибактериальным антимикотическим раствором. Затем перенесите образец лимфатической мальформации или четыре образца кожи в пробирку и снова взвесьте пробирку, чтобы определить вес ткани.

Затем в шкафу биологической безопасности второго класса с помощью стерильных щипцов перенесите ткань и среду в 100-миллиметровую чашку для культуры тканей с помощью стерильных ножниц. Наконец, измельчаем ткань на кусочки размером в один кубический миллиметр. Затем переложите кусочки в 50 миллилитровую пробирку с 10 миллилитрами свежего антибиотического антимикотика. Терпимая.

Прокрутите пробирку несколько раз, чтобы снова суспендировать ткань, а затем поверните образец вниз. После удаления надосадочной жидкости добавьте один миллилитр теплого раствора для варежения на 100 миллиграмм измельченной ткани и инкубируйте ткань в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с постоянным встряхиванием при 200 об/мин Для успешного обогащения клеток лимфатического эндотелия. Очень важно распознать, когда клетки подверглись достаточному воздействию коллагеназы и пространственной реакции, чтобы они пережили изоляцию.

Это достигается за счет тщательного контроля за процессом переваривания тканей и остановки реакции, когда большая часть тканей была переварена на мелкие фрагменты. В конце инкубации убедитесь, что почти вся ткань переварилась на мелкие фрагменты, и отфильтруйте тканевую суспензию через ситечко 70 микрон в стерильную пробирку объемом 50 миллилитров. Теперь с помощью трехмиллилитрового шприцевого поршня с резиновым поршнем измельчите оставшиеся ткани до тех пор, пока не будут наблюдаться лишь небольшие следы внеклеточного матрикса.

Затем промойте клеточный фильтр объемом эндотелиальной клеточной среды, эквивалентным объему диссоциирующей ферментной среды и раскрутите клетки reus. Суспендируйте гранулу в количестве до 20 миллилитров эндотелиальной клеточной среды, в зависимости от размера образца. Затем, после подсчета семян, дважды по 10 к шести клеткам в колбе площадью 150 квадратных сантиметров предварительно кодируют фибронектин в окончательном объеме 20 миллилитров эндотелиальной клеточной среды для ночного культивирования.

На следующее утро смойте несвязанные клетки тремя полосканиями PBS с добавлением антимикотического раствора антибиотика. Затем, чтобы увеличить количество лимфатических эндотелиальных клеток, добавьте к клеткам свежую среду эндотелиальных клеток и инкубируйте культуру в течение пяти-семи дней до тех пор, пока культура не станет примерно на 80% конфлюентной. Окрашивать клетки для сортировки методом многопараметрической флуоресцентной сортировки активированных клеток.

Сначала удалите клеточные среды, трижды промойте клетки в PBS. Затем добавьте семь миллилитров раствора для отслоения после пяти-семиминутной инкубации при 37 градусах Цельсия. Соберите диссоциированные клетки, инактивируйте ферменты тремя объемами эндотелиальной клеточной среды и перенесите клеточную суспензию в стерильную пробирку.

Центрифугируйте ячейки трижды, промывая гранулу в пяти миллилитрах PBS на второй и третий спины после последней промывки. Повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах свежей PBS и подсчитайте количество жизнеспособных клеток путем исключения трианового синего. Последующий подсчет клеток.

Асептически переносите клетки в проточные цитометрические красящие трубки и вращайте клетки вниз, чтобы блокировать неспецифическое связывание. Повторно суспендируйте клетки в 5% F-B-S-P-B-S и инкубируйте на льду в течение 20 минут. После блокировки центрифуги клетки удаляют надосадочную жидкость и ресус.

Суспендируйте гранулу в CD 34, CD 31 потанине и коктейле антител третьего рецептора VEGF. После 20 минут со льдом трижды промойте клетки в двух миллилитрах F-B-S-P-B-S, чтобы удалить все несвязанные антитела и резус. Суспендировать гранулу в 300 микролитрах йодида пропидиума в растворе F-B-S-P-B-S на льду.

Наконец, отсортируйте очищенные лимфатические эндотелиальные клетки человека на многопараметрическом приборе для сортировки флуоресцентных активированных клеток. Затем отсортированные клетки раскрутить вниз и восстановить суспензию гранул в соответствующей среде для посева клеточных культур. Здесь показаны нормальные лимфатические сосуды человека и сосуды с лимфатической мальформацией, меченные антителами против деплана горшка, при этом отмечается заметное расширение и значительное изменение размера просвета в сосудах лимфатической мальформации человека.

Действительно, большинство лимфатических мальформаций содержат как мелкие или микрокистозные, так и большие или макрокистозные аномальные кистозные структуры после первоначального переваривания тканей и 24-часового посева в нефракционированных образцах. Отдельные колонии эндотелиальных клеток могут наблюдаться в дополнение к фибробластоподобным клеткам и гладкомышечным клеткам после сортировки и в течение последующих 24 часов в клеточной культуре. Тем не менее, CD 34, низкий CD 31 положительный VEGF рецептор трех положительных плоскостей подо и положительные клетки, прикрепленные к контейнеру для культивирования, демонстрируют типичную морфологию булыжника, наблюдаемую на этих изображениях.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как с высокой степенью чистоты изолировать лимфатическую эндотелиальную клетку, выстилающую лимфатическую мальформацию человека и полные лимфатические сосуды кожи, с помощью сортировки флуоресцентных активированных клеток. Не забывайте, что работа с первичными тканями человека может быть опасной, так как они могут содержать вредные для здоровья человека инфекционные агенты. При выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать стандартные меры предосторожности, такие как ношение перчаток, защитных очков и лабораторного халата.