Комбинированные Условный Нокдаун и Адаптированные Сфера Формирование Анализ для изучения Stemness-Ассоциированный ген пациента полученных стволовых клеток рака желудка

В этом протоколе мы представляем экспериментальную конструкцию с использованием условной нокдаунной системы и адаптированного анализа формирования сферы для изучения влияния кластерина на ствольность ГКС, полученных пациентом. Протокол может быть легко адаптирован для изучения как in vitro, так и in vivo функции генов, связанных со стволом, в различных типах CSC.

Раковые стволовые клетки вовлечены в рак рецидива метастазы на лекарственная устойчивость. Этот протокол обеспечивает эффективный метод для исследования функций ключевых генов в раковых стволовых клетках. Используя условную систему нокдауна и адаптированный анализ формирования сферы, этот метод легко адаптируется для изучения функций in vitro и in vivo на генах, связанных со стволовыми заболеваниями, в различных типах раковых стволовых клеток.

Демонстрируя процедуру, будут Yuting Li и Xiangyu Tan, научные сотрудники из моей лаборатории. Для генерации частиц лентивируса семя четырех миллионов 293T лентивирусных упаковочных клеток в 100-миллиметровую чашку Петри с 10 миллилитров DMEM дополнено 10%FBS. Инкубировать клетки на ночь при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа, убедившись, что клетки от 50 до 80% стечения в день трансфекции.

Довнесите пониженную сооте число сыворотки до комнатной температуры и подготовь трубки A и B в соответствии с рукописными указаниями. Добавьте содержимое трубки А в трубку B.Mix хорошо и инкубировать трубку в течение 15 минут при комнатной температуре для подготовки липидо-ДНК комплексов. Удалите пять миллилитров медиума из блюда клеточной культуры.

Затем добавьте пять миллилитров липидно-ДНК комплекса в клеточной культуры блюдо падение мудрым и осторожно вихрем блюдо. Инкубировать культуру блюдо в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. После инкубации осторожно удалите трансфекцию среды и замените ее 10 миллилитров предварительно разогретого DMEM, дополненного 10%FBS.

Инкубировать клетки в течение еще 24 часов. Приблизительно 48 часов после трансфекции, урожай 10 миллилитров лентивируса, содержащего супернатанты и фильтровать их с 0,45 микрометра залить фильтр для удаления клеточного мусора. Все сосуды клеточной культуры, советы, фильтры и шприцы могут содержать лентивирус и должны быть обработаны 10%bleach до удаления.

Перенесите уточненный супернатант в стерильный контейнер. Добавьте концентратор Lenti-X и смешайте с нежной инверсией. Инкубировать смесь при четырех градусах по Цельсию на ночь.

На следующий день центрифуга образца в 1500 раз G в течение 45 минут при четырех градусах Цельсия. Аккуратно удалите супернатант, заботясь о том, чтобы не нарушить гранулы внизу. Аккуратно повторно приостанавливайте гранулы в один миллилитр DMEM, дополненный 10%FBS и храните его при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Семя 6 миллионов стволовых клеток рака желудка или GCSC в 100-миллиметровую чашку Петри с 10 миллилитров DMEM дополнены 10%FBS. Культура клетки в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. Когда клетки достигают 70 до 80% стечения, аспирировать среду из блюда и добавить концентрированные лентивирусные частицы, разбавленные четырьмя миллиметрами полной среды DMEM, содержащие полибренский реагент.

Верните клетки в инкубатор на 18 часов. Полибрен следует проверить в различных условиях, чтобы определить эффективную концентрацию, которая, как правило, в диапазоне от двух до 10 миллиграмм на миллилитр. Через 18 часов замените носитель на 10 миллилитров DMEM на 10%FBS и верните клетки в инкубатор на 24 часа.

Затем аспирировать супернатант с клеточным мусором и добавить свежий DMEM дополнен 10%FBS и 2,5 микрограмма на миллилитр пуромицина. Инкубировать клетки в течение еще 24 часов. Затем снова измените среду на свежий DMEM, дополненный 10%FBS и пятью микрограммами на миллилитр пуромицин.

После еще 24-часовой инкубации, промыть приверженец GCSCs дважды с пятью миллилитров DPBS без кальция и магния. Разобщить клетки одним миллилитром предварительно разогретого раствора диссоциации клеток и инкубировать их в течение двух-трех минут при 37 градусах по Цельсию. Затем добавьте пять миллилитров свежей предварительно разогретой среды полной культуры GCSC к клеточной подвеске.

Раздай три миллилитра этой подвески в 15-миллилитровую центрифугу для криоконсервации, а остальные три миллилитров в другую трубку для индукции с доксициклином. Центрифуга обе трубки при 800 раз G в течение пяти минут. Затем, аспирировать супернатант из трубки B и повторно приостановить клетки в один миллилитр свежей предварительно разогретой GCSC полной среде культуры.

Семя соответствующее количество клеток в новую 100-миллиметровую чашку Петри с 10 миллилитров свежих предварительно разогретых GCSC полной культуры среды и 2,5 микрограмма на миллилитр доксициклина. Затем инкубировать блюдо в течение 48 часов. Используйте автоматизированный счетчик ячеек для определения плотности 10 микролитров выборки клеток.

Затем отрегулируйте объем с предварительно разогретой средой полной культуры GCSC, чтобы получить концентрацию 20 000 жизнеспособных клеток на миллилитр. Выпределите 100 микролитров клеточной подвески в каждую колодец новой, сверхнизкой пластины 96 хорошо культуры. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом.

Формирование сферы должно происходить в течение трех-десяти дней. Изображение образования опухолевой сферы каждые два дня. Стволовые клетки рака желудка из первичной аденокарциномы желудка человека были выучинены в среде свободной культуры сыворотки.

Через шесть дней клетки расширились от одноклеточного фенотипа до больших сфер. Для оценки функции кластерина в GCSCs, короткие последовательности шпильки РНК против кластерина были клонированы в вектор Tet-GV307-RFP-Puro. Клетки, трансфицированные вектором экспрессии, обработались доксициклином в течение 48 часов.

Затем экспрессия кластерина была проверена западной помаркой и количественно определена денситометрией. Наличие доксициклина и нокдауна кластерина в ГККС тормозят образование опухолевых сфер. В то время как ингибирование образования опухолевой сферы не наблюдалось в клетках, трансуцированных с помощью скремблированных шРНК-контроля, указывая, что только доксициклин не препятствует образованию опухолевых сфер.

Эти результаты показывают, что после замалчивания кластерина, GCSCs растут медленно и не могут образовывать опухолевые сферы. Основываясь на этих данных, кластерин играет решающую роль в содействии самообувечению деятельности GCSCs, указывая, что это может быть перспективной целью наркотиков для подавления раковых стволовых клеток у больных раком желудка. Опухолевые сферы должны быть твердыми круглыми структурами на отдельных или агрегированных клетках, не следует считать опухолевыми сферами.

Тем не менее, некоторые раковые стволовые клетки не могут образовывать типичные структуры сферы опухоли. Эта процедура может следовать с другими методами для изучения стволовых клеток рака для возобновляемых потенциальных in vitro. Например, можно изучить выражение маркеров, связанных со стеблем.

Протокол может быть расширен для изучения функций критических генов в раковых стволовых клетках, таких как стебель на выживание.