TMT Пример ы подготовки к протеомики объекта представления и последующего анализа данных

Основными преимуществами этого протокола являются то, что он снижает затраты на маркировку, улучшает извлечение белка и генерирует высококачественные данные. Основными преимуществами нашего протокола являются высокая эффективность маркировки для различных типов образцов, его воспроизводимость и надежное получение данных. После изоляции четырехглавой мышечной ткани образцы из усыпляемой мыши в соответствии с IACUC утвержденный протокол, весят 10 миллиграммов мышечной ткани и использовать пинцет, чтобы отделить мышечные волокна.

Чтобы создать лизат, перенесите разделенный образец ткани в двухмиллилитровую трубку, содержащую 200 микролитров одного миллиметра zirconia silica beads и 500 микролитров буфера lysis CHAPS. Поместите образцы в разрушитель бисера и выполните два последовательных 45-секундных пробега. После второго цикла, чтобы освободить ДНК-связанный белок, sonicate образца 10 раз в течение 10 секунд на sonication на 50% амплитуды с 30-секундными интервалами на льду.

После последней звуковой передачи центрифуга лизировать и перенести супернатант в новую центрифугу трубки. Для уменьшения/алкилации реагентной обработки, перенесите 200 микрограммов белка на состояние в новые центрифуговые трубки и используйте свежий буфер лиза CHAPS, чтобы довести конечный объем в каждой трубке до 100 микролитров. Затем добавьте пять микролитров TCEP к каждой трубке и инкубировать образцы при 55 градусах по Цельсию в течение одного часа.

В конце инкубации растворите девять миллиграммов иодоацетамида в 132 микролитров 100 миллимолярный TEAB и защитите полученный 375-миллимолярный иодоацетамидный раствор от света. Затем добавьте пять микролитров иодоацетамида в каждый образец и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре, защищенной от света. Для высыпания метанола/хлороформа добавьте 400 микролитров метанола к каждому 100 микролитров белка и кратко вихрейте образцы.

Для включения жидкостей, депонированных по бокам пробных труб, кратко центрифуга образцов и добавить 100 микролитров хлороформа в каждой трубке. После краткого вихря, быстро центрифуги труб снова собрать жидкость по бокам труб и добавить 300 микролитров воды в образцы. Vortex энергично получить однородные растворы и центрифугировать образцы в течение одной минуты в тех же условиях центрифуги.

В конце центрифуги, перенесите трубки тщательно на стойку, не нарушая слоев и тщательно удалить супернатант. Добавьте 300 микролитров метанола в оставшиеся меж- и нижние фазы и вихрь образцы энергично снова. Центрифуга образцов в течение двух минут и тщательно аспирировать supernatants.

Затем аккуратно аспирировать как можно больше жидкости из каждого образца, как это возможно под потоком воздуха, пока гранулы просто немного влажной. Оцените гидратацию каждые две минуты в течение примерно 10 минут. При необходимости гранулы можно хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию до дальнейшей обработки.

Чтобы переварить белок, повторно усыпите осажденные гранулы в 100 микролитров буфера лиза TEAB и добавьте 100 микролитров раствора хранения трипсина к нижней части 100 микрограммов трипсина стеклянный флакон. Через пять минут при комнатной температуре добавьте 2,5 микролитров свежеприготовленного трипсина раствора на 100 микрограммов белка в каждый образец и инкубировать образцы при температуре 37 градусов по Цельсию за ночь. Для маркировки пептидов растворите каждый 0,8 миллиграмм tMT тег флакон с 41 микролитров ацетонитрила ангидроуса на тег и инкубировать реагенты в течение пяти минут при комнатной температуре с редкими вихрями, сохраняя при этом этикетки защищены от света.

В конце инкубации кратко центрифугайте флаконы и аккуратно добавьте 41 микролитер реагента этикетки TMT к каждому 100 микролитровому образцу для часовой инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации, утолить реакции с добавлением восьми микролитров 5%гидроксиламин в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем разделить образцы на равные aliquots в новых трубок центрифуги для хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

В этом репрезентативном приобретении данных было проанализировано 39 653 пептида, из которых 4 457 имели равные или более двух уникальных пептидов и 3 829 включали ионы репортеров для всех каналов. Для определения относительного распределения белков от больных было использовано изменение складок по сравнению со здоровыми клетками с 296 белками значительно меньшего изобилия и 108 белками значительно более высокого изобилия. Анализ PANTHER показал классифицированный список белков, основанный на значительно более низком или более высоком изобилии больных клеток на основе их молекулярной функции.

Струнный анализ белков значительно более низкого или более высокого изобилия еще больше выявил несколько взаимодействий и сильную связь между белками. Дополнительные методы могут быть выполнены для выявления белково-белковых взаимодействий, классификации взаимодействий по группам и выявления взаимодействий в различных путях. Методы протеомики являются мощными инструментами в биомедицинских областях исследований для понимания механизмов развития болезни путем предоставления подробной информации об изобилии белка.