7,156 Views
•
08:44 min
•
August 21, 2020
DOI:
Эта модель гемодинамической петли позволяет исследователям проверить несовместимость в пробирке гемо сосудистых устройств, таких как перфузионые трубки или стенты. на стандартизированных условиях. Таким образом, этот метод не оказывает никакого влияния на кровь с помощью механической силы и тем самым избежать вводящих в заблуждение результатов внутренней активации компонентов крови.
Перед попыткой эксперимента необходимо практиковать правильную механическую сборку деталей, идеальную конструкцию системы замыкания петли и медленную загрузку крови в петли. Для подготовки петли сборки, использовать резак трубки сократить 250 сантиметров в длину, пять миллиметров внутреннего диаметра куски труб на плоской поверхности. И подключите открытые окончания труб в короткий кусок силиконовой трубки установки внешнего диаметра следственной трубки для создания формы петли.
Тщательно затяните запирающиеся винты разъема натяжения и отрегулируйте силу закрытия так, чтобы между двумя изгибами не осталось зазора. Если замок винт полностью ужесточены и напряжение поликарбонатной полосы кажется слишком низким, чтобы закрыть разрыв между двумя изгибами, открыть систему блокировки и сократить несколько миллиметров натяжения полосы. Чтобы подготовить сборку стентового цикла, откройте две петли и вынюхив трубку из системы натяжения.
Затем вставьте стент в середину трубки по указанию производителя. Когда соответствующее количество петель для эксперимента были созданы безопасные петли в петле колыбели вращения блока, за пределами 37 градусов водяной бани и прикрепить петлю колыбели к блоку вращения внутри водяной бани. Затем заполните один 10 миллилитров шприц на каждые две петли крови, которые будут собраны с 150 микролитров или свежеприготовленный раствор гепарина фонда и использовать 21 калибровочных бабочки, чтобы аккуратно собирать кровь в шприцы, заботясь, чтобы избежать гомолиза или активации клеток из-за чрезмерного вакуума.
Когда вся кровь была собрана передачи крови в стакан и использовать пять миллилитров серологических пипетки, чтобы аккуратно смешать кровь и гепарин. Когда однородный раствор был получен с кончиком пипетки не полностью вставляется в трубку, тщательно, заполнить каждую петлю с пятью миллилитров крови. Закройте каждый цикл после того, как он был заполнен и подтвердить, что петля, натяжение полосы и стойки должным образом обеспечены.
Затем поверните петли в течение трех часов при 30 оборотов в минуту. В конце вращения, позвольте петли стоять в стойке в течение двух минут, чтобы кровь накапливается на петле днища, прежде чем тщательно открыть разъемы и потянув кровь из дубликатов в отдельных 10 миллилитров стеклянные стаканы. Когда вся кровь была собрана промыть каждую трубку с 10 миллилитров PBS и использовать скальпель тщательно сократить один сантиметр образца от конца каждой трубки.
Инкубировать образцы на ночь в 2%glutaraldehyde при четырех градусах по Цельсию, а затем 15 минут инкубации и 1%osmium тетроксида при комнатной температуре. В конце инкубации осмия тетроксида обезвоживает образцы в восходящей серии этанола в течение 20 минут на концентрацию, а затем 30 минут обезвоживания в 100% этанола. В конце 100%-ной инкубации этанола, пусть образцы высыхают на ночь при комнатной температуре перед визуализацией образцов путем сканирования электронной микроскопии при ускорении напряжения в пять киловольт, с помощью рентгеновского микро-КТ сканера.
Для цитометрического анализа кровотока. Передача 100 микролитров крови из каждого образца в каждый из девяти пяти миллилитров FACS труб и исправить образцы с добавлением 100 микролитров 4%power формальдегида на трубку в течение 15 минут при комнатной температуре защищены от света. После мытья, повторно приостановить каждую гранулу в один миллилитр красного буфера лиза крови на трубку, в течение пяти минут инкубации при комнатной температуре, защищены от света.
В конце инкубации, мыть образцы центрифугации в один миллилитр PBS на трубку и поместить образцы без их supernatants на льду. Для подготовки одного пятна компенсации шарики добавить четыре капли положительных и четыре капли отрицательных шариков в отдельных один миллилитр объемов буфера FACS, и вихрь решения для получения однородной подвески шарика. Добавьте 100 микролитров каждого раствора к каждой из четырех или пяти миллилитров facS труб помечены как указано и мыть бисер с одним миллилитром буфера FACS на трубку.
Далее добавьте 100 микролитров соответствующего вихревого коктейля антител к каждой экспериментальной и флуоресценции минус одна трубка с нежным смешиванием. В течение 30 минут инкубации при комнатной температуре, защищенной от света. В конце инкубации промойте образцы одним миллилитром свежего буфера FACS на образец и заново потух в 250 микролитров буфера FACS на трубку.
Перед анализом бисера на образцах клеток по цитометрии потока, в соответствии со стандартными протоколами. Распределение клеток крови можно визуализировать по всей поверхности сращивания двух bloops микро КТ и сканирование электронного микроскопа изображения в то время как сгустки не наблюдаются в закрытых петлях без пробелов. Анализ всего количества клеток крови, не показывает значительных различий в цифрах эритроцитов между любым из проверенных условий, тромбоцитов и лейкоцитов номера однако, резко снижается в группе латексной петли и свободные номера гемоглобина резко увеличилось, что свидетельствует о очень плохой биосовместимости латекса.
В то время как все проверенные сосудистые устройства вызывают повышенную активацию системы коагуляции и комплимент компонента. Гепарин покрытием ПВХ петли демонстрируют тенденцию к снижению уровня обоих типов активаций по сравнению с полимерным покрытием, ПВХ петли. Латексные петли демонстрируют самые высокие уровни TNF IL-6 и PMN elastase, подчеркивая мощную активацию лейкоцитов латексом.
CD41 положительные тромбоциты, восстановленные из латексных трубок, демонстрируют чрезвычайно высокую медианную интенсивность флуоресценции для CD62P, в то время как интегрированное выражение резко снижается на гранулоцитах и лимфоцитах. Интерес, интегральные уровни выше в моноцитах из латексных трубок, предлагая моноцитов активированных взаимодействий тромбоцитов. Действительно окрашивание для моноцитов тромбоцитов агрегатов показывает повышенную тенденцию к агрегации в латексных и стентовых петлях.
Несмотря на снижение частоты моноцитов в латексных петлях. Чтобы избежать активации внутреннего компонента крови, важно обеспечить надлежащее закрытие петли и обращаться с кровью с осторожностью. Таким образом, после этой процедуры, можно проанализировать взаимодействие между аллогенными белками или TRUCKs и компонентов крови, которые используются в воспалении или фармацевтических исследований.
Здесь представлен протокол для стандартизированной модели гемодинамической петли in vitro. Эта модель позволяет проверить гемо совместимость перфузиочных труб или сосудистых стентов в соответствии со стандартом ISO (Международная организация по стандартизации) 10993-4.
11:08
Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases
Видео по теме
16047 Views
10:15
The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits
Видео по теме
11660 Views
07:30
In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling
Видео по теме
9679 Views
06:27
A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium
Видео по теме
9506 Views
10:24
In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions
Видео по теме
10714 Views
09:12
In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology
Видео по теме
1628 Views
09:19
In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time
Видео по теме
8990 Views
08:53
In Vitro Model Integrating Substrate Stiffness and Flow to Study Endothelial Cell Responses
Видео по теме
505 Views
08:44
An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices
Видео по теме
7.2K Views
00:00
Cell Migration and Cell Adhesion Assays to Investigate Leishmania-Host Cell Interaction
Видео по теме
1.2K Views
Read Article
Цитировать это СТАТЬЯ
Wacker, M., Betke, U., Borucki, K., Hülsmann, J., Awad, G., Varghese, S., Scherner, M., Hansen, M., Wippermann, J., Veluswamy, P. An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices. J. Vis. Exp. (162), e61570, doi:10.3791/61570 (2020).
Copy