Оптимизированный подход к протеомике на основе масс-спектрометрии с использованием выбранных участков ткани

Нами разработан оптимизированный метод изучения протеома в конкретных областях высших образцов тканей с помощью масс-спектрометрии. Наша цель состоит в том, чтобы усовершенствовать протеомный метод, включая пробоподготовку и масс-спектрометрический анализ, для достижения высокой точности и надежности. Одной из проблем пространственной протеомики на основе FFPE является неполное переваривание белка, что снижает общее покрытие белка.

Для их преодоления требуются оптимизированные протоколы пищеварения и усовершенствованные стратегии масс-спектрометрии для улучшения глубины и точности протеома. Мы выявили различные белковые изменения при различных типах заболевания поджелудочной железы, что позволило получить представление о различиях между доброкачественными и предраковыми состояниями. Эти результаты могут помочь в ранней диагностике рака поджелудочной железы.

Мы стремимся усовершенствовать метод протеиназы пациента для достижения картирования белков с высоким разрешением в областях тканей. Используя протеомику, основанную на масс-спектрометрии, мы стремимся идентифицировать региональные молекулярные сигнатуры, которые способствуют открытию биомаркеров. Наш подход объединяет эти захваты пациента и предварительную подготовку с независимой от данных событийной масс-спектрометрией для быстрого получения высококачественных данных протеома из выбранных областей ткани FFPE.

Этот метод позволяет получить большую количественную оценку пространственного протеома. Для начала приготовьте окрашенный гематоксилином и эозином или иммуногистохимически окрашенный предметный стекал тканей с областью интереса, указанной патологоанатомом. Поместите предметное стекло без пятен, и скольжение с окрашенной тканью сдвинется спиной к спине, обеспечивая правильное выравнивание.

С помощью скальпеля удалите участки ткани, которые не представляют интереса, и соскребите интересующие участки тканей ближе к центру предметного стекла. Переложите собранную ткань в чистую пробирку объемом 1,5 миллилитра с низким связыванием белка и добавьте в каждую пробирку 180 микролитров буфера для лизиса SDS. Выполняйте ультразвуковую обработку зондом с амплитудой 20% в течение 10 циклов по пять секунд включения и пяти секунд с выключением.

Теперь инкубируйте образцы при температуре 100 градусов Цельсия в течение 3,5 часов, сохраняя скорость 1000 G. После инкубации дайте образцу остыть при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем центрифугируйте при 16 000 G в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы отделить остатки тканей от надосадочной жидкости. Соберите надосадочную жидкость в пробирку с чистой этикеткой и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшего использования.

Для осаждения ацетона поместите образец белка, соответствующий 100–300 микрограммам, в пробирку, совместимую с ацетоном. Затем добавьте ледяной ацетон, предварительно охлажденный до минус 20 градусов Цельсия, в объеме, в пять раз превышающем объем образца. Выдерживайте смесь при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение 18 часов.

После инкубации центрифугируйте пробирку при 16 000 G в течение 15 минут. Аккуратно утилизируйте надосадочную жидкость, не нарушая белковую гранулу. Добавьте 500 микролитров ацетона, темперированного при температуре минус 20 градусов Цельсия, и центрифугируйте.

После сцеживания надосадочной жидкости просушите образец на воздухе. Приготовьте суспензию, улавливающую буфер для лизиса в деионизированной воде. Затем добавьте 40 микролитров приготовленного буфера в пробирку с образцом и тщательно перемешайте, чтобы растворить высушенную на воздухе белковую гранулу.

Поместите образец в встряхивающий инкубатор при температуре 100 градусов Цельсия и 1000 G на 35 минут. Далее добавьте в образец 10 микролитров алкилирующего реагента и инкубируйте образец при комнатной температуре при 300 G в течение одного часа. Внутри вытяжного шкафа для химикатов добавьте в образец пять микролитров 10% трихлоруксусной кислоты, сделав общий объем 55 микролитров.

Проверьте pH образца с помощью бумаги pH, чтобы убедиться, что он меньше единицы. Далее добавьте в образец 350 микролитров связывающего буфера номер один, чтобы захватить белки. Поместите колонну для улавливания суспензии в двухмиллилитровую пробирку и перенесите весь образец, включая любой нерастворимый материал, в колонку.

Центрифугируйте колонку при 4000 G в течение 50 секунд, чтобы захватить белки. Затем добавьте 400 микролитров буфера для стирки два. После центрифугирования выбросьте проточный поток.

После окончательной промывки центрифугируйте колонку при 4 000 G в течение 1,25 минут, чтобы обеспечить полное прохождение буферной единицы. Добавьте 125 микролитров буфера для сбраживания в колонну для улавливания суспензии и закройте ее крышкой, чтобы предотвратить испарение. Инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение 18 часов без встряхивания.

Теперь добавьте 80 микролитров элюирующего буфера 1 в колонну для улавливания суспензии и центрифугируйте при 4000 G в течение 1,25 минуты. Вытяните элюированные пептиды и переложите их в чистую новую пробирку. После количественного определения пептидов лиофилизируйте 20 мкг пептидов.

Повторно растворите лиофилизированные пептиды в 40 микролитрах водного буфера, содержащего 3% ацетонитрила, в воде с 0,1% муравьиной кислотой и ультразвуком в течение 10 минут в ультразвуковой ванне. Центрифугируйте образец при 16 000 G в течение 60 минут и переложите надосадочную жидкость в пробирки для масс-спектрометрического анализа. Введите по два микролитра каждого образца с помощью автосамплера системы масс-спектрометрии наножидкостной хроматографии.

Разделяйте пептиды на колонке с обратной фазой, упакованной из материала C18 на три микрометра с использованием 127-минутного градиента от пяти до 35% ацетонитрила со скоростью 100 нанолитров в минуту. Ионизируйте пептиды с помощью источника ионов нанораспыления и перенесите их в масс-спектрометр на основе Orbitrap. Анализируйте пептиды с помощью метода сбора данных в узком диапазоне.

Точная изоляция области интереса во время обработки тканей FFPE была достигнута в различных панкреатозных цистозных формалин-фиксированных парафинах. Были получены воспроизводимые хроматограммы общих ионов между биологическими трирепликатами для каждого типа кистозного новообразования поджелудочной железы. Методом жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии выявлено 9 703 белка.

Распространенность всех идентифицированных белков составила 6,25 порядков величины, демонстрируя всестороннее покрытие протеома, и были количественно определены известные маркеры белка рака поджелудочной железы. Всего было идентифицировано 933 дифференциально экспрессируемых белка, из которых 457 были повышены и 476 подавлены при внутрипротоковых папиллярных муцинозных новообразованиях. Биоинформатический анализ показал, что дифференциально экспрессируемые белки были связаны с несколькими путями, связанными с раком поджелудочной железы.