Выделение фекальной (микро) РНК

Представлен протокол выделения РНК из образцов кала для исследования микроРНК. Этот протокол может быть использован для выделения РНК из кала с высоким качеством и количеством. Он минимизирует количество РНК живых микробов.

Важно подчеркнуть, что и буфер привязки в данном протоколе не используется. Этот протокол прост и понятен. Начните с суспендирования от 25 до 100 мг образцов кала в 600 микролитрах стерильного 1X DPBS в двухмиллилитровой микроцентрифужной пробирке.

Инкубируйте пробирку, содержащую образец, при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем разомните смесь с помощью кончика пипетки объемом в один миллилитр и хорошо переборщите. Повторно суспендируйте смесь в гомогенизаторе с настройкой на один цикл при 4 000 оборотов в минуту в течение 45 секунд для оптимизации и увеличения количества и качества РНК.

Добавьте в образец 600 микролитров раствора кислотного фенола хлороформа и перемешайте смесь в течение 60 секунд. В качестве альтернативы, чтобы оптимизировать увеличение количества РНК в выходе, смешайте его с гомогенизатором. Центрифугируйте образец в течение 15 минут при 10 000 x g при комнатной температуре, чтобы разделить водную и органическую фазу.

Повторяйте центрифугирование до тех пор, пока интерфейс не станет компактным. Осторожно перенесите верхнюю водную фазу, не нарушая нижнюю, в новую двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку с шарнирной крышкой. Добавьте 100% этанол марки ACS в 1,25 раза больше объема полученной водной фазы и завихрейте в течение трех секунд.

Поместите фильтрующий картридж в сборные трубки. Загрузите по 600 микролитров каждого из образцов в фильтрующий картридж, входящий в комплект для выделения микроРНК. Центрифугируйте при давлении 10 000 x g в течение 90 секунд, чтобы отфильтровать смесь через картридж.

Затем выбросьте фильтрат. Повторяйте это до тех пор, пока весь объем смеси не будет отфильтрован через одну и ту же фильтрующую мембрану при последовательном применении. После этого образец фильтруется.

добавьте 700 микролитров промывочного раствора микроРНК 1 в тот же фильтрующий картридж. Центрифугируйте в течение 60 секунд, чтобы отфильтровать моющий раствор через фильтрующий картридж. Выбросьте фильтрат и поместите фильтрующий картридж на ту же сборную трубку.

Промыть фильтрующий элемент 700 микролитрами промывочного раствора 2/3, приготовленного в 100% этаноле марки ACS и центрифугировать при 10 000 х г в течение минуты. Выбросьте полученный фильтрат и поместите фильтрующий картридж в ту же трубку. Промойте фильтрующий картридж 500 микролитрами промывочного раствора 2/3 и центрифугируйте при 10 000 х г в течение минуты.

Выбросьте полученный фильтрат и поместите фильтрующий картридж в ту же сборную трубку. Промыть фильтрующий элемент 250 микролитрами промывочного раствора 2/3, приготовленного в 100% этаноле марки ACS и центрифугировать при 10 000 х г в течение минуты. Выбросьте полученный фильтрат и поместите фильтрующий картридж в ту же сборную трубку.

Наконец, перенесите картридж фильтра в новую сборную трубку и вращайте узел в течение пяти минут, чтобы удалить остатки жидкости. Переложите картридж фильтра в новую сборную трубку, затем добавьте 50 микролитров воды, не содержащей нуклеаз, в центр фильтра и закройте трубку крышкой. Инкубируйте трубку при комнатной температуре в течение 10 минут.

Затем вращайте пробирку в течение пяти минут при 8 000 x g, чтобы восстановить РНК в новую пробирку для сбора. Анализ РНК с помощью электрофореза на основе чипов позволяет предположить, что репрезентативные изоляты РНК из фекалий мышей и человека имеют низкое или полное отсутствие композиций 18S и 28S рРНК, а размер изолятов РНК находится в малой области РНК. Еще один электрофорез с малой РНК с помощью электрофореза на основе чипа показал, что большая часть РНК имеет размер микроРНК.

Чистота выделенной РНК была высокой, о чем свидетельствует коэффициент поглощения 2,0 для длин волн 260 и 280 нм и значение коэффициента 1,8 для поглощения на длинах волн 260 и 230 нм. Чтобы обеспечить успех органической экстракции, убедитесь, что поверхности очевидны и передают только верхнюю водную фазу, не нарушая нижнюю фазу, даже за счет уменьшения объема нашей водной фазы.