Подготовка образцов для метаболического профилирования с использованием масс-спектрометрии MALDI

Масс-спектрометрия MALDI Imaging является уникальным достижением в области метаболомики, которое позволяет нам измерять и визуализировать относительное содержание и распределение метаболитов, которые указывают на организмы, физиологические и патологические состояния. Основным преимуществом MALDI Imaging является его способность обнаруживать метаболиты в С2 без необходимости мечения. Вы демонстрируете процедуру с вами Сами Саума, аспирантом из лаборатории доктора Патрисии Касита.

Юки Чен и Келли Вирасамми, студенты-исследователи из моей лаборатории. После сбора урожая сразу же помещают салфетку в жидкостную азотную, охлажденную, алюминиевую фольгу лодочку и ящик из полистирола. Закройте полистирольную коробку крышкой, чтобы заморозить салфетку на 2-10 минут, в зависимости от размера ткани.

Когда ткань достаточно замерзнет, с помощью щипцов снимите лодочку и транспортируйте ткань, закрепленную внутри фольги на сухом льду, к криостату. Перед тем как разрезать ткани, соблюдайте осторожность, чтобы не дышать на горках. Используйте перчатки и вольтметр, настроенный на сопротивление, чтобы проверить проводимость соответствующего количества совместимых с MALDI стекол с покрытием из оксида индия и олова для анализа.

После нанесения этикетки поместите слайды на чистое бумажное полотенце и установите криостат, очищенный от 70% этанола, при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Поместите образец ткани в криостат и установите температуру камеры криостата и головки образца в соответствии с типом ткани. После того, как ткань уравновесится в течение 30 минут, используйте состав для встраивания криоткани, чтобы прикрепить ткань к патрону.

И поместите и зафиксируйте чистое лезвие в предметном столике, отрегулируйте положение предметного столика и угол наклона образца для достижения желаемого угла резки. И разрежьте ткань до тех пор, пока не будет выявлен интересующий участок. Когда желаемая область будет достигнута, получите срезы толщиной от 10 до 12 микрон, используя предварительно охлажденную кисть, чтобы осторожно, но быстро собрать каждую секцию на маркированной стороне каждого предметного стекла по мере их получения.

Поместите палец под слайды, чтобы прогреть секции, чтобы обеспечить надежное крепление к слайду. Секции становятся прозрачными через 5-10 секунд и становятся непрозрачными примерно через 30-60 секунд. Когда все секции будут собраны, поместите предметные стекла в держатель слайдов и поднесите сухой лед к осквернителю.

В качестве альтернативы горки можно перевозить в вакуумной коробке. Поместите предметные стекла в очиститель с адсорбентом и высушите их в вакууме в течение 45-60 минут. После высыхания, если вы не используете сразу, поместите слайды в транспортер слайдов и заполните транспортер азотом.

Заклейте держатель парапленкой и поместите держатель в пакет с застежкой-молнией. Затем поместите первый пакет с застежкой-молнией во второй пакет с маркировкой, содержащий влагопоглотитель для хранения при температуре минус 80 градусов Цельсия до шести месяцев. После обезвоживания используйте жирный серебристый маркер, чтобы нанести метки X на пустые места предметных стекол за пределами участков тканей, и используйте черный тонкий маркер, чтобы поместить второй черный крестик поверх каждого серебряного X. Загрузите один предметный предмет в металлическую мишень для предметного стекла MALDI и накройте предметное стекло пластиковой крышкой.

Наметьте местоположение образца на пластиковой крышке и поместите предметное стекло и мишень MALDI на поверхность планшетного сканера. Затем просмотрите слайд и выберите нужную область. Отсканируйте слайд в 16-битной шкале серого, с точностью 2 400 точек на дюйм и сохраните изображение для последующего использования.

Чтобы нанести матрицу на слайды, включите автоматический матричный распылитель, убедившись, что клапан расположен под нагрузкой, и запустите программное обеспечение опрыскивателя. Убедитесь, что вытяжной вентилятор работает правильно, и подтвердите на вкладке «Связь», что система правильно взаимодействует. Запустите насос растворителя со скоростью 100 микролитров в минуту с противодавлением примерно 500 фунтов на квадратный дюйм.

И установите азотный бак на 30 фунтов на квадратный дюйм, чтобы начать подачу сжатого воздуха к матричному распылителю. Отрегулируйте регулятор давления на передней части распылителя до 10 фунтов на квадратный дюйм и установите температуру форсунки опрыскивателя по желанию. С помощью клапана и положения загрузки используйте шприц, чтобы промыть петлю семью миллилитрами 70% метанола, прежде чем заполнить петлю шестью миллилитрами матрицы.

Поместите пустое стекло в держатель и распылитель, заклеив оба конца скотчем, чтобы предотвратить движение, и убедитесь, что скорость потока и температура стабильны. Нажмите кнопку «Пуск», чтобы установить температуру форсунки и отрегулировать расход насоса в соответствии с выбранным методом. Переключите клапан с нагрузки на распыление и нажмите «Продолжить».

Дали системе запуститься до конца. Когда осаждение будет завершено, переключите клапан с распыления на загрузку и нажмите «Продолжить». Рассмотрите схему матричного кодирования под микроскопом.

Если наблюдается ровный слой мелкодисперсного кристалла матрицы, нанесите матрицу на соответствующие предметные стекла, как показано выше. После обработки всех предметных стекол очистите систему в соответствии с инструкциями производителя, чтобы предотвратить засорение форсунки опрыскивателя. Здесь показаны выходные изображения с помощью анализа данных MALDI MS Imaging спектров массового разряда, выбранных из каждого интервала Дальтона из каждых 100 дальтоновских интервалов, которые наглядно демонстрируют полезность для идентификации спектров от низкомолекулярных метаболитов до высокомолекулярных липидов.

На каждой дороге изображены соответствующие ионные тепловые карты, содержащие как пространственную, так и спектральную информацию о конкретном виде метаболитов в трех тканях, собранных на 1, 21 и 60 день после рождения. Сильной стороной методологии MALDI MSI является способность различать специфичность определенных видов, идентифицируемых по отношению массы к заряду к этапам развития или конкретным анатомическим структурам. В этом анализе было обнаружено, что некоторые метаболиты обогащаются у новорожденных в первый день после рождения или у взрослых в постнатальный день 60 лет, или равномерно распределяются по испытуемым возрастам.

Было обнаружено, что другие молекулярные виды специфически обогащены серым веществом, белым веществом или спинномозговой жидкостью и желудочками. Также было проанализировано пространственное распределение репрезентативных метаболитов, включая гипоксантин, глутаминовую кислоту, N-ацетиласпарагиновую кислоту, арахидоновую кислоту и несколько липидов. Для поддержания точности метаболических статов решающее значение для предотвращения искусственных метаболических изменений имеют надлежащее препарирование образцов, хранение и сиро-срезы.

После проведения эксперимента с MALDI вы можете захотеть проверить идентичность найденных метаболитов. Это может быть достигнуто с помощью микроэкстракции и жидкостной хроматографии в тандеме МС. MALDI MS Imaging облегчает метаболомные исследования с пространственным разрешением и дает исследователям возможность получить метаболические данные в количественной и визуальной среде. В последнее время существует большой интерес к влиянию диеты на нейродегенеративные расстройства, взаимосвязь между микробиомом кишечника и мозгом.

Таким образом, изучение метаболизма в нейронауке имеет огромное значение, начиная с нейроразвития и заканчивая нейродегенерацией. Главный факт взаимодействия кишечника и мозга. И именно в этом контексте идея установки MALDI Imaging может действительно предоставить выдающиеся технологии для визуализации эффекта, который конкретная манипуляция может оказать на мозг.