Визуализация ТОРС-КоВ-2 с использованием иммуноРНК-флуоресценции в гибридизации Ситус

Этот протокол позволил визуализировать РНК SARS-CoV-2 в клеточных линиях и в полностью дифференцированных трехмерных культурах эпителия дыхательных путей человека, предоставив инструмент для лучшего понимания патогенеза и репликации вируса на уровне отдельных клеток. Благодаря своей высокой специфичности, чувствительности и разрешающей способности этот метод полезен не только для фундаментальных научных исследований SARS-коронавируса-2, но и для прикладных проектов, таких как диагностика. Демонстрировать процедуру будет Агнешка Зудер, аспирант из моей лаборатории.

После фиксации и пермеабилизации ячеек, как описано в рукописи текста, удалите из лунок раствор 1X PBS и добавьте в каждую лунку не менее 300 микролитров амплификационного буфера. Инкубируйте образцы в течение 30 минут при комнатной температуре. Подготовьте каждую шпильку HCR путем мгновенного охлаждения нужного объема в отдельных пробирках.

Для приготовления 300 микролитров раствора для амплификации используйте по 18 пикомолев каждой шпильки. Перелейте раствор шпильки в пробирки, и инкубируйте их при температуре 95 градусов Цельсия в течение 90 секунд. Затем остудить до комнатной температуры в течение 30 минут в темноте.

Приготовьте смесь для шпилек, добавив охлажденные шпильками H1 и H2 в буфер для усиления. Нанесите капли от 30 до 50 микролитров смеси шпилек на Парапленку. Поместите покровные стекла с ячейками на капли шпилечной смеси и инкубируйте образцы в течение ночи в темноте при комнатной температуре.

Чтобы установить предметные стекла, поместите две капли монтажного материала объемом 10 микролитров на предметное стекло, убедившись, что капли отделены друг от друга достаточно, чтобы на одном предметном стекле можно было разместить два покровных стекла. Удалите лишнюю жидкость, постучав покровными стеклами по чистому полотенцу. Затем поместите их в монтажную среду, препятствующую выцветанию, ячейками вниз.

Поместите установленные образцы на сухую плоскую поверхность в темноте и дайте им застыть. После фиксации и пермеабилизации клеток НАО, как описано в рукописи текста, предварительно амплифицируйте образцы путем их инкубации с амплификационным буфером в течение 30 минут при комнатной температуре. С помощью 30 пикомолев каждой шпильки приготовьте 500 микролитров раствора для амплификации.

Перелейте раствор шпильки в трубки, и инкубируйте их при температуре 95 градусов Цельсия в течение 90 секунд. Затем остудите их до комнатной температуры в течение 30 минут в темноте. Приготовьте раствор для шпилек, добавив все охлажденные шпильки в 500 микролитров амплификационного буфера при комнатной температуре.

Удалите раствор для предварительного усиления и добавьте весь раствор для шпильки. Затем инкубируйте образцы в течение ночи при комнатной температуре в темноте. Поместите вырезную мембрану из вставок Transwell на 10 микролитров монтажной среды с защитой от выцветания ячейками вверх и добавьте дополнительную монтажную среду к мембране.

Затем накройте мембраны покровными стеклами. Этот протокол иммуно-РНК-FISH был проведен в двух клеточных системах: клеточной линии Vero и 3D-культуре эпителия дыхательных путей человека. Показана локализация субгеномной РНК SARS-коронавируса-2 в инфицированных и ложно инокулированных клетках Vero.

Вирусная РНК может быть видна красным цветом. Показана локализация субгеномной РНК SARS-коронавируса-2 в инфицированных и ложно инокулированных эпителиальных клетках дыхательных путей человека. Протокол пермеабилизации был оптимизирован в клетках Vero.

Пермеабилизация с помощью детергента приводит к четкому, специфическому сигналу для субгеномной РНК SARS-коронавируса-2, в то время как использование этанола приводит к размытому и несфокусированному изображению. При монтаже предметных стекол с ячейками Vero важно разместить покровное стекло ячейками вниз. При монтаже предметных стекол HAE мембрану необходимо размещать клетками вверх.

Этот метод может быть легко модифицирован для обнаружения любых РНК, включая некодирующие РНК и РНК-вирусы, которые могут появиться в будущем. В сочетании с иммунофлуоресценцией он может быть использован для изучения взаимодействий белка и РНК на уровне отдельных клеток.