Сочетание Клей-ленты на основе выборки и флуоресценции На месте Гибридизация для быстрого обнаружения Сальмонеллы На Fresh Produce

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы соединить отбор проб свежих продуктов с помощью клейкой ленты с молекулярным детектированием видов сальмонеллы на целых клетках с помощью быстрой флуоресценции при гибридизации C-2, также известной как рыба. Это достигается путем наложения липкой ленты на нужный материал и извлечения поверхностно связанных клеток. Ленты для заряда элемента могут быть проанализированы непосредственно или подвергнуты обогащению в твердой или жидкой фазе.

Второй этап процедуры – это лента, самофиксация и обезвоживание в этаноловом ряду для клеток, на которые ссылается бульон или обогащают им. Второй этап включает фиксацию клеток в суспензии с последующей суспензией Resus клеток в буфере для хранения. Третий этап процедуры заключается в выполнении быстрой стадии гибридизации на ленте с использованием коктейля олигонуклеотидных зондов, специфичного для сальмонеллы, с последующим удалением избытка зонда с помощью промывочной буферной промывки для образцов, проанализированных по факсу, на рыбной стадии проводится в суспензии, а избыток зонда может быть удален с помощью простой стадии разбавления перед анализом.

Заключительным этапом процедуры является противодействие окрашиванию гибридизованных ленточных клеток DPI и их исследование с помощью флуоресцентной микроскопии. Для анализа, основанного на фактах, противодействующее пятно не требуется. В конечном счете, этот метод предоставляет средства для визуального или цитометрического обнаружения видов сальмонелл, которые могут присутствовать на отобранных свежих продуктах.

Впервые идея этого метода пришла мне в голову, когда я прочитал об итальянской группе, которая использовала аналогичный подход для изучения бактериальных сообществ на римских аэрокаменных реликвиях. Но мы с Р. обсуждали эту работу на занятии, которое я преподавал на быстрых методах в пищевой микробиологии. Несколько недель спустя вспышка сальмонеллы, связанная со свежими продуктами, в конечном итоге унесла жизни почти 1500 человек в 43 штатах

Несмотря на то, что наш экспериментальный подход предлагает своевременный и практичный способ обнаружения конкретных типов бактерий на свежих продуктах, он также достаточно портативный, чтобы его можно было тестировать в полевых условиях или в условиях производства продуктов питания. Начните с выбора ленты, которую вы будете использовать для отбора проб. Некоторые варианты включают в себя коммерчески доступную грибную ленту или контактную ленту, которые стерильны и также упакованы для удобства использования.

С помощью перманентного маркера нарисуйте квадраты в один сантиметр на 10-сантиметровой стороне 10-сантиметрового куска клейкой ленты с помощью стерильного алюминиевого шаблона. Это послужит визуальным руководством для того, чтобы отметить, какая часть ленты была использована для отбора проб пищевой или экологической поверхности в форме CS петли ленты липкой стороной, обращенной к поверхности для отбора проб. Для этого придерживайте липкие концы большим и средним пальцами и расположите указательный палец напротив нарисованного квадрата на обратной стороне ленты.

Поместите ленту на поверхность для отбора образца и аккуратно прижмите отмеченный участок к поверхности, не отпуская края ленты. Указательным пальцем следите за тем, чтобы липкая сторона ленты полностью соприкасалась с поверхностью образца. Избегайте образования пузырей ровным движением.

Медленно оттяните ленту от образца. Физически извлекая поверхностно связанные микробы, они закрепляют заряд ячейки. Приклейте клейкой стороной вверх к предметному стеклу стеклянного микроскопа Используя обычную прозрачную офисную ленту, обеспечьте правильное натяжение и растяжение ленты, чтобы создать плоскую неморщинистую поверхность.

Это поможет свести к минимуму проблемы с деформацией или скручиванием ленты. Во время последующего нагрева. Во время гибридизации поместите ленту лицевой стороной вниз на пластины для нарезки ксилозы на четырех или четырех сельскохозяйственных пластинах так, чтобы отобранные клетки находились в непосредственном контакте с сельскохозяйственной поверхностью, что облегчает снятие ленты с сельскохозяйственной поверхности.

После обогащения контактная часть ленты с шаблонным образцом размещается заподлицо с поверхностью agri, и один конец ленты свободно приклеивается. Боковые стенки пластин чашки Петри перевернуты, чтобы избежать конденсации, и инкубируются при температуре 35 градусов Цельсия. Чтобы обеспечить достаточный рост видов сальмонелл, продолжительность инкубационного периода, необходимого для обогащения клеток до обнаруживаемого уровня, будет зависеть от начальных уровней заражения сальмонеллой.

По истечении нужного периода обогащения откройте агаровую пластину, лента сохранит свою липкость при инкубации. Аккуратно прижмите ленту к агару с помощью указательного пальца, чтобы обеспечить максимальное восстановление образовавшихся микроколоний На границе ленты агара возьмите ленту с края, прикрепленного к стенке чашки Петри, и снимите ее медленным ровным движением. Используя обычную прозрачную офисную ленту, закрепите ленту для заряда ячейки липкой стороной вверх на предметном стекле микроскопа, чтобы получилась плоская поверхность без морщин

Проводите фиксацию на ленте в течение 30 минут при температуре 25 градусов Цельсия, покрывая область контакта образца 500 микролитрами 10% нейтрального буферизованного формина. Выбросьте фиксатор в герметичный контейнер под химическим колпаком, чтобы свести к минимуму воздействие раздражающих или токсичных паров, промойте ленту один раз в одном x фосфатно-солевой буфер или PBS, аккуратно затопив поверхность ленты PBS, чтобы обезвожить образец. Используя прогрессивную серию этанола, приготовьте буферы предварительной гибридизации и промывки с помощью коммерческого фильтра растворов класса молекулярной биологии с помощью шприца с острием 22 микрометра и предварительно нагрейте буферы для гибридизации и промывки до 55 градусов Цельсия.

Добавьте флуоресцентно меченные олигонуклеотидные зонды в предварительно нагретый гибридизационный буфер для получения конечной концентрации зонда пять нанограммов на микролитр, наложите на поверхность контакта с шаблонным образцом 300 микролитров гибридизационного буфера, содержащего зондовый коктейль и гибридизованные связанные лентой клетки, во влажной герметичной инкубационной камере, установленной при температуре 55 градусов Цельсия для инкубатора прямого контакта, Например, инструмент для работы в режиме скольжения в гибридном режиме на 15 минут. После гибридизации предметные стекла удаляются, а зонд, содержащий наложение буфера для гибридизации, отбраковывается. Коротко и аккуратно промойте предварительно подогретым буфером для стирки с помощью пипетки.

Небольшой объем буфера над наклонным предметным стеклом позволяет сушить предметные стекла на воздухе для обнаружения видов сальмонеллы с помощью флуоресцентной микроскопии. Нанесите на предметное стекло около 10 микролитров векторного щита Н 1200, монтажный носитель, содержащий dpi, ядерное противоморочное пятно выдержите в темноте в течение 10 минут. Нанесите иммерсионное масло на крышку, наденьте и исследуйте образцы с помощью масляного объектива с большим увеличением.

Фильтр DPI используется для того, чтобы сфокусировать образец. Затем микроскоп переключается на соответствующий фильтр, и клетки сальмонеллы визуально оцениваются в соответствии с их зеленой или красной флуоресценцией, в зависимости от того, какой краситель используется для маркировки зондов. При переднем цитрическом детектировании взвешенные образцы PBS переносят в пятимиллилитровые пробирки с круглым дном и исследуют с помощью проточного цитометра с возбуждением на 647 нанометрах.

Анализируйте данные с помощью программного обеспечения FlowJo. Забор образцов terica serovar, Ty Murium с поверхности искусственно загрязненного томата с помощью клейкой ленты, облегчает прямой анализ рыбы с помощью микроскопии или заряда клеток проточной цитометрии. Ленты обрабатывали для быстрой флуоресценции в гибридизации C-2 с использованием комбинации специфичных для сальмонеллы ДНК-зондов и помечали Texas Red, в зависимости от исходной локальной концентрации клеток сальмонеллы на ленте.

Обогащение твердой фазой дало результаты, варьирующиеся от изолированных микроколоний до слияний сил. Отобранные на ленте клетки могут быть проанализированы с помощью комбинированной рыбной и проточной цитометрии либо сразу после отбора проб, либо после пятичасового воздействия на поверхность жидкости. Обогащение мини-культур при 35 градусах Цельсия.

Несмотря на то, что мы описали использование метода ленточной рыбы для обеспечения безопасности пищевых продуктов, этот метод также имеет хороший потенциал для использования в других дисциплинах, включая микробиологию окружающей среды, патологию растений или клиническую микробиологию. Параллельно с этой процедурой могут быть проведены дополнительные эксперименты, такие как биохимическое тестирование или ПЦР, с обогащением твердой или жидкой фазой из образцов, экстрагированных лентой. Тесты могут быть использованы для ответа на вопросы о сальмонелле, которые могут присутствовать, вопросы, выходящие за рамки процедуры с рыбой.