Высокопроизводительный анализ микропластинчатого питателя для количественной оценки потребления дрозофилы
14 июня 2021 г.
Микропластинчатый питатель предлагает экономичный, высокопроизводительный метод количественной оценки потребления жидких пищевых продуктов при дрозофиле. 3D-печатное устройство соединяет 96-скважинную микропластину, в которой мухи размещены, с микропластиной с 1536 скважинами, из которой мухи потребляют питательный раствор с индикаторным красителем. Уменьшение объема раствора измеряется спектрофотометрически.
Анализ микропластинчатой подачи обеспечивает простой, высокопроизводительный, экономичный метод измерения пищевого поведения дрозофилы и предлагает множество преимуществ по сравнению с другими, более сложными методами. Количественная оценка расхода путем измерения поглощения с помощью пластинчатого считывателя исключает ручные измерения и исключает ручной ввод данных. Данные также поддаются программному извлечению и обработке.
С помощью этого высокопроизводительного анализа мы можем количественно оценить потребление водорастворимых питательных веществ, лекарств, фармацевтических препаратов или токсинов, и система может быть модифицирована для применения к различным видам насекомых. Начните с разлива расплавленной агарозы в реагентную желоб и дозируйте 80 микролитров расплавленной агарозы в каждую лунку 96-лунки микропластины с помощью многоканальной пипетки. Охладить оставшуюся агарозу до недели в герметичном пакете и переплавлить ее для изготовления дополнительных пластин.
Если барьерные полосы слишком свободны, обвяжите их вокруг пальца, чтобы придать им кривизну, чтобы удерживать их в каналах. Вставьте барьерные полосы в каналы барьерной полосы для подготовки муфт. Прикрепите муфту к голодной пластине, следя за тем, чтобы не использовать муфту для манипулирования пластиной, так как муфта может соскользнуть.
Убедитесь, что угловой угол соединительного муфты соответствует угловым углам микропластины, чтобы сохранить правильную ориентацию. Под анестезией CO2 сортируйте трех-пятидневных мух. Загружайте отдельных мух колонной в пластину голодания.
Закройте каждый столбец по мере его заполнения, отрегулировав его барьерную полосу в закрытое положение. Тщательно запишите макет образца внутри микропластины. Как только пластина голодания будет заполнена, позвольте мухам спонтанно восстановиться после удаления CO2 и голодайте их в течение шести часов, начиная с их первоначального времени обезболивания.
Приготовьте 10 миллилитров жидкой пищи в конической пробирке объемом 15 миллилитров, растворив 0,4 грамма сахарозы и 0,1 грамма дрожжевого экстракта в 10 миллилитрах дистиллированной воды. Вихряйте трубку до тех пор, пока твердые вещества полностью не растворятся. Добавьте 40 микролитров раствора красителя и переложите жидкую пищу в шприц на 10 миллилитров с фильтром 0,45 микрометра.
Фильтруйте приблизительно 1,5 миллилитра раствора за один раз в 1,7-миллилитровую микроцентрифужную трубку. Отложите шприц, содержащий раствор, в сторону и отфильтруйте дополнительный раствор по мере необходимости во время приготовления питательной пластины. Подготовьте питательную пластину, запечатав дно микропластины из 1536 скважин уплотнительной пленкой.
Используйте уплотнительное весло, чтобы тщательно прилипать к пленке. Затем обрежьте лишнюю пленку с левого и правого краев лезвием бритвы. Распределить 10 микролитров отфильтроированной жидкой пищи в верхнем левом колодце для каждого кластера из четырех скважин микропластины из 1536 скважин.
После того, как все колодцы заполнены, нанесите уплотнителюющую пленку на верхнюю часть пластины, следуя тем же шагам, которые используются для герметизации нижней части микропластины. Повторите для нужного количества пластин. Центрифугировать пластины в 200 раз G в течение 10 секунд, чтобы оседать жидкость.
Не позволяйте пластине охлаждаться, так как это может привести к накоплению конденсата в скважинах, заслоняя показания поглощения. Перфорировать колодцы на верхней поверхности пластины игольчатым зондовым инструментом, оснащенным иглой диаметром 0,25 миллиметра, используя тот же порядок перфорации, который использовался при дозировании растворов. Протрите иглу между растворами, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
Переверните плиту и перфорируют колодцы на дне. Считывание поглощения пластины на 630 нанометров без крышки. Поместите внутреннюю крышку на верхнюю уплотнителевую пленку, чтобы убедиться, что конденсационные кольца окружают перфорированные колодцы, затем поместите внешнюю крышку на пластину.
Поместите питательную пластину лицевой стороной вверх на муфту таким образом, чтобы направляющие выровняли соответствующие отверстия пластины питателя и пластины голодания. Убедитесь, что соединитель и пластины правильно ориентированы. После того, как все фидерные пластины загружены на муфты, откройте колодцы для плит, отрегулировав барьерные полосы на соединителях.
Поместите соединитель и пластинчатые узлы во вторичный контейнер. Поместите нижнюю половину коробки для пипетки, содержащую размоченные бумажные полотенца, в каждый дополнительный контейнер, чтобы обеспечить влажность. Закройте крышку вторичного контейнера и перенесите его в контролируемую среду.
Дайте мухам потреблять в течение 22 часов. После 22 часов воздействия проверьте каждую пластину на наличие мертвых мух и обновите макет пластины соответствующим образом. После того, как все пластины проверены, обезболивайте мух в массовом порядке, закачивая CO2 внутрь вторичного контейнера.
Примерно через 60 секунд убедитесь, что все мухи обездвижены. Осторожно постучите мухами в пластину голодания и замените пластиковые барьерные полосы. Снимите фидерные пластины для считывания.
Перечитайте поглощение пластины на 630 нанометров. Повторяйте процесс до тех пор, пока не будут прочитаны все пластины. Испарение было количественно оценено для каждой скважины и было обнаружено, что определяет, существуют ли какие-либо корреляции между скважинами отдельных плит.
Коэффициенты корреляции Пирсона для испарения по отношению к рядам и испарения по отношению к столбцам были рассчитаны для оценки тенденций между испарением и расположением скважины. Потребление трех-пятидневных мух Canton-SB было количественно определено, чтобы установить действительность протокола. Мухам был предоставлен выбор между 4% раствором сахарозы с 1% дрожжевым экстрактом и 4% раствором сахарозы, дополненным 15% этанолом и 1% дрожжевым экстрактом.
Как мужчины, так и женщины показали подавляющее предпочтение раствору с этанолом и дрожжевым экстрактом. Важно поддерживать последовательность при строительстве фидерных пластин, гарантируя, что каждая муха представлена с идентичным сценарием потребления в отношении объема пищи, испарения и доступа. Этот метод позволит исследователям в области дрозофилы выполнять высокопроизводительный анализ потребления и предпочтительного поведения с более высокой пропускной способностью и с более низкой стоимостью по сравнению с традиционными методами.
Обзор
Метод с использованием подачи корма через микропланшет представляет собой высокопроизводительный способ количественной оценки пищевого поведения Drosophila. Этот экономичный подход предполагает использование устройства, напечатанного на 3D-принтере, для соединения микропланшетов, что позволяет эффективно измерять потребление жидкого корма.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Поведенческая биология
- Энтомология
Теоретическая часть
- Измерение пищевого поведения Drosophila имеет решающее значение для понимания предпочтений в питании.
- Традиционные методы могут быть трудоемкими и менее эффективными.
- Метод анализа с использованием микропланшетной системы кормления оптимизирует этот процесс.
- Для сбора данных используются спектрофотометрические измерения.
Цель исследования
- Разработать высокопроизводительный метод оценки потребления пищи у Drosophila.
- Облегчить количественное определение различных питательных веществ и соединений.
- Повысить эффективность исследований пищевого поведения.
Используемые методы
- Подготовка агарозы и микропланшетов для анализов по потреблению корма.
- Сортировка и анестезия мух для экспериментов по контролируемому кормлению.
- Измерение абсорбции для количественной оценки потребления корма.
- Анализ данных для выявления тенденций в пищевом поведении и предпочтениях.
Основные результаты
- Мухи проявили предпочтение к корму, содержащему этанол и дрожжевой экстракт.
- Сбор данных был оптимизирован за счет автоматизированного измерения абсорбции.
- Скорость испарения была количественно определена и проанализирована на наличие корреляций.
- Данный анализ оказался эффективным для высокопроизводительных исследований питания.
Выводы
- Метод анализа с использованием микропланшетной системы кормления является ценным инструментом для исследований Drosophila.
- Он позволяет эффективно и точно измерять пищевое поведение.
- Данный метод может быть адаптирован для различных видов насекомых и различных областей применения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественная оценка потребления пищи у модельных организмов способствует валидации мишеней и фенотипическому скринингу на ранних этапах поиска новых соединений. Метод анализа с использованием микропланшетного фидера позволяет проводить высокопроизводительное измерение потребления жидкого корма у Drosophila, предоставляя количественные данные для механистического снижения рисков при изучении нутриционных, токсикологических или фармакологических вмешательств. Данный подход повышает достоверность прогнозов при идентификации ведущих соединений за счет стандартизации показателей потребления на больших выборках образцов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтические гипотезы путем количественного определения потребления питательных веществ, токсинов или лекарственных препаратов на генетически модифицируемой модели.
- Практическая ценность: Обеспечивает биологическую проверку рисков с помощью стандартизированного метода измерения потребления жидкого корма на основе абсорбции.
- Прогностическая ценность: Способствует отбору приоритетных направлений в портфеле исследований путем получения воспроизводимых данных о потреблении для скрининга соединений.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов анализа путем изоляции потребления корма отдельными мухами в многолуночных форматах.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет использования герметичных микропланшетов и контролированной коррекции испарения.
- Масштабируемость: Возможность проведения скрининга и повторного использования платформы благодаря напечатанным на 3D-принтере переходниках, которые синхронизируют микропланшеты на 96 и 1536 лунок.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: описывает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации, обеспечивая возможность анализа зависимости «доза-ответ» для потребляемых соединений.
- Механистическое снижение рисков: фокусируется на прогностической значимости при оценке поведенческих реакций на такие вещества, как этанол или дрожжевой экстракт.
- Релевантная заболеванию система: позволяет проводить исследования признаков, связанных с потреблением, с учетом средовых и фармакологических переменных.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в процесс исследований — от проверки гипотез до идентификации перспективных соединений, обеспечивая количественное поведенческое фенотипирование.
- Открывающая биология: объясняет, как данный метод способствует проверке гипотез, уточнению путей передачи сигналов или снижению биологических рисков посредством количественного определения потребления жидкого корма.
- Скрининг: описывает готовность анализа, воспроизводимость или количественные результаты, подтвержденные в статье измерениями абсорбции до и после потребления.
- Аналитика: освещает измерения, результаты считывания или статистические данные, которые помогают командам сравнивать условия, включая коррекцию на испарение и корреляционный анализ Пирсона.
- Трансляционные исследования: связывает метод с непрерывностью доклинических исследований или согласованием биомаркеров только в тех случаях, когда источник подтверждает это через тесты на предпочтение между растворами сахарозы и растворами с добавлением этанола.
- Корпоративное повторное использование: представляет метод как многократно используемую возможность, а не как одноразовую технику, благодаря применению напечатанных на 3D-принтере соединителей и протоколов герметизации.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: прогностическая достоверность, валидация мишеней, снижение механистической неоднозначности фенотипов, связанных с потреблением.
- Операционная ценность: стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость за счет измерения абсорбции в микропланшетах и использования контролей в барьерных стрипах.
- Стратегическая ценность: более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних этапах благодаря проведению высокопроизводительных анализов предпочтений и потребления.
- Влияние на портфель: приоритезация и принятие решений о дальнейшем продвижении проектов с учетом рисков на основе количественных данных о поглощении для библиотек соединений.
Особенности реализации
- Необходим соответствующий научный опыт работы с Drosophila, подготовки микропланшетов и проведения спектрофотометрии.
- Требования к инструментальной и аналитической инфраструктуре включают планшетные ридеры с возможностью измерения абсорбции на 630 nm и системы соединителей, изготовленные на 3D-принтере.
- Требования к стандартизации между исследовательскими группами в отношении герметизации, перфорации и контроля условий окружающей среды для минимизации артефактов, вызванных конденсацией и испарением.
- Вопросы адаптации для различных модельных систем, с учетом возможности применения метода для других видов насекомых при модификации состава корма.
- Практические ограничения, подтвержденные исходными материалами: необходимо количественно оценить и скорректировать испарение; охлаждение планшетов вызывает конденсацию, которая затрудняет считывание показателей; для правильного доступа к лункам требуется строгое соблюдение ориентации соединителя и микропланшетов.
