Метод изучения токсичности и агрегации α-синуклеина с использованием гуманизированной дрожжевой модели

Это простой метод мониторинга клеточных фенотипов и особенностей Ядер R-пасса. Он также может быть часто восстановлен в общегеномном исследовании, чтобы найти генетические факторы, влияющие на стабильность Ядер R-пасса. Поскольку это хорошо зарекомендовавший себя двигательный организм, этот метод прост и не требует много времени и усилий по сравнению с использованием клеточных линий человека или животных моделей.

Агрегация Ядер R-пасса тесно связана с болезнью Паркинсона. Белки или химические вещества, которые, вероятно, влияют на стабильность Ядер R-пасса, могут быть протестированы в этой гуманизированной дрожжевой модели. Для начала нанесите три одиночные колонии на агаровую пластину SD-URA для отбора клеток, содержащих плазмиды альфа-синуклеина.

Затем инокулируют три пластырных дрожжевых трансформанта на штамм в 3 миллилитра SRD-URA для селективного роста дрожжей, содержащих плазмиды, с 2% рафинозой для ингибирования индукции альфа-синуклеина под промотором Gal1 и 0,1% глюкозы. Инкубируют инокулированную культуру при 30 градусах Цельсия при перемешивании со скоростью 200 оборотов в минуту. На следующий день инокулируйте ночные культивируемые клетки в 3 миллилитра свежего SRD-URA, пока они не достигнут оптической плотности 0,2 при 600 нанометрах.

Затем инкубируют культуру в течение шести часов при 30 градусах Цельсия при перемешивании со скоростью 200 оборотов в минуту. Измерьте оптическую плотность на 600 нанометров с помощью спектрофотометра. Затем разбавляют образцы до оптической плотности 0,5 при 600 нанометрах стерильной дистиллированной водой в полосе 1 96-луночной пластины для выравнивания количества клеток в каждой культуре.

Выполнить 5-кратное последовательное разведение дрожжевых клеток путем добавления 160 микролитров стерильной дистиллированной воды в следующие пять полос и обеспечить общий объем 40 микролитров при последовательном разбавлении клеток в каждой полосе. Используйте многоканальную пипетку для передачи 10 микролитров из каждой скважины, чтобы обнаружить образцы на агаровых пластинах SD-URA для элементов управления и агаровых пластинах SG-URA для мониторинга токсичности. Высиживайте пятнистые пластины вверх ногами при 30 градусах Цельсия в течение четырех дней.

Делайте снимки пластин каждые 24 часа до четвертого дня, а затем анализируйте данные, сравнивая различия в росте между штаммами, замеченными глазом. Инокулируют три пластырных дрожжевых трансформанта на штамм в три миллилитра SRD-URA и инкубируют при 30 градусах Цельсия при перемешивании со скоростью 200 оборотов в минуту в течение ночи. На следующий день измерьте оптическую плотность клеток, культивируемых в течение ночи, на 600 нанометров и инокулируйте клетки в общей сложности на 200 микролитров свежих SD-URA и SG-URA в 96-луночных пластинах.

Отрегулируйте конечный объем, включая ячейки, до 200 микролитров и отрегулируйте начальную оптическую плотность ячейки до 0,05 при 600 нанометрах. Отрегулируйте параметры программы в микротитровой пластине. Установите целевую температуру на уровне 30 градусов по Цельсию, интервальное время до 15 минут, продолжительность встряхивания до 890 секунд, амплитуду встряхивания до 5 миллиметров и измерение как поглощение на 600 нанометров.

Инкубируйте пластину в течение 2-3 дней, чтобы все штаммы достигли стационарной фазы в считывателе микропластин. Проанализируйте данные, построив кривую роста. Инокулируют пластырные дрожжевые трансформанты в 3 миллилитра SRD-URA и культивируют их на ночь при 30 градусах Цельсия при перемешивании со скоростью 200 оборотов в минуту.

На следующий день повторно инокулируют культивируемые на ночь клетки в 3 миллилитра свежего SRD-URA до оптической плотности 0,003 при 600 нанометрах, затем инкубируют культуру при 30 градусах Цельсия при перемешивании при 200 оборотах в минуту, пока оптическая плотность не достигнет 0,2. Затем добавляют 300 микролитров 20% галактозы, а затем инкубируют еще 6 часов при 30 градусах Цельсия при перемешивании при 200 оборотах в минуту. Собирают один миллилитр клеточной культуры методом центрифугирования при 800 г в течение 5 минут и выбрасывают супернатант.

Аккуратно повторно суспендируйте гранулу ячейки в 30 микролитрах дистиллированной воды. Приготовьте агарозную гелевую прокладку на стеклянной горке. Повторно суспендируйте клетки и загрузите пять микролитров ресуспензии клетки на стеклянную горку и накройте клетки с помощью разрезанной агарозной прокладки для исследования.

Для выполнения микроскопической визуализации с объективом 100x используйте опцию захвата экрана для создания изображений с помощью программы и выберите brightfield для фокусировки ячейки со 100-кратным объективом с помощью погружного масла. Переключитесь на флуоресцентный фильтр GFP и отрегулируйте время экспозиции изображения от 50 миллисекунд до 300 миллисекунд для получения четкого изображения путем балансировки отношения сигнал/шум. Откройте файл изображения и проанализируйте данные, подсчитав ячейки на основе количества очагов в ячейках с помощью программного обеспечения для анализа изображений.

Экспрессия синуклеина под промотором Gal1 в векторе PRS426 показала значительную задержку роста на агаровой пластине, содержащей галактозу в качестве индуктора. Разница в росте по экспрессии синуклеина наблюдалась и в жидких культурах. В обоих условиях культивирования синуклеин дикого типа и варианты с мутациями E46K или A53T показали дефекты роста из-за токсичности синуклеина.

Однако вариант синуклеина A30p, который не образует агрегатов, показал нетоксичный фенотип. Штаммы, проявляющие выраженную цитотоксичность, показали очаги агрегатов синуклеина, но в варианте A30p менее токсичная форма синуклеина была диффундирована по клеткам. Для достижения воспроизводимых результатов важно использовать клетку на одной и той же стадии роста в каждом эксперименте, особенно при мониторинге фенотипов, связанных с синуклеином.

Как мы показали в данных флуоресцентного микроскопа, синуклеин может образовывать более крупные агрегаты. Поэтому он может быть просто фракционирован центрифугированием и может быть количественно определен западным блоттингом с использованием синуклеин-специфического антитела. Этот метод применим для высокопроизводительного скрининга для поиска новых генетических факторов и химических соединений, влияющих на агрегацию синуклеина.

Таким образом, мы надеемся найти новых терапевтических кандидатов для болезни Паркинсона.