Визуализация mtHyPer7, ратиометрического биосенсора для митохондриальной перекиси, в живых клетках дрожжей
2 июня 2023 г.
Перекись водорода (H2O2) является одновременно источником окислительного повреждения и сигнальной молекулой. Этот протокол описывает, как измерить митохондриальныйH2O2 с помощью митохондриального HyPer7 (mtHyPer7), генетически кодируемого ратиометрического биосенсора, у живых дрожжей. В нем подробно описывается, как оптимизировать условия визуализации и выполнять количественный клеточный и субклеточный анализ с помощью бесплатного программного обеспечения.
Митохондрии — это органеллы в клетках, которые способствуют мобилизации энергии, центральному метаболизму, производству жизненно важных макромолекул, накоплению кальция и передаче сигналов. В результате они играют решающую роль в клеточной функции, физической форме и контроле продолжительности жизни. Наше исследование сосредоточено на изучении влияния митохондрий на старение с использованием почковающихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве модельного организма.
Визуализация живых клеток является нашим лучшим инструментом для наблюдения за изменениями в митохондриальной функции. В этой статье мы опишем метод, в котором используется генетически закодированный биосенсор с метрическим спектральным сдвигом соотношения, называемый митохондриальным HyPer7. mtHyPer7 обнаруживает перекись водорода, активную форму кислорода, которая может повреждать клеточные компоненты, но также функционирует как сигнальная молекула в митохондриях живых клеток.
mtHyPer7 обладает высоким сродством к перекиси водорода и низкой чувствительностью к pH. Он интегрирован в геном дрожжей, что приводит к стабильной и последовательной экспрессии в популяциях дрожжевых клеток. Наконец, он количественно нацелен на митохондрии и не оказывает заметного влияния на клеточную или митохондриальную функцию или приспособленность.
Биосенсоры, такие как mtHyPer7, имеют решающее значение для изучения функции митохондрий при субклеточном разрешении, для поиска механизмов, лежащих в основе контроля качества митохондрий, и для изучения того, как этот процесс влияет на приспособленность клеток, питание и продолжительность жизни. Краситель mtHyPer7 обеспечивает стабильную работу в отличие от органических красителей, используемых для обнаружения активных форм кислорода. По сравнению с датчиками на основе FRET, mtHyPer7 более компактен и позволяет избежать таких проблем, как перекрестное возбуждение и прокачка, а также требований к точному позиционированию и ориентации для FRET.
Обзор
Это исследование изучает митохондриальную функцию у пивных дрожжей Saccharomyces cerevisiae, сосредоточившись на роли перекиси водорода (H2O2) как в качестве вредного агента, так и сигнального молекула. Используя генетически закодированный рациональный биосенсор, mtHyPer7, исследователи описывают метод для количественного измерения митохондриального H2O2 в живых клетках.
Ключевые компоненты исследования
Область исследования
- Митохондриальная функция
- Окислительный стресс
- Старение у дрожжей
Фон
- Митохондрии необходимы для клеточного производства энергии и сигнализации.
- H2O2 может вызывать окислительное повреждение, но также действует в сигнальных путях.
- Физическая форма митохондрий связана с продолжительностью жизни клетки и её здоровьем.
Используемые методы
- Изображение живых клеток с биосенсором mtHyPer7
- Модельный организм: Saccharomyces cerevisiae
- Флуоресцентная микроскопия для количественного анализа
Основные результаты
- Успешное изображение уровней митохондриального H2O2 в живых клетках дрожжей.
- Установлены оптимальные условия для визуализации и анализа изображений.
- Показано, что mtHyPer7 не влияет на клеточную функцию или ее приспособленность.
Выводы
- Это исследование демонстрирует надежный метод измерения митохондриального H2O2 и его влияние на клеточное здоровье.
- Оно способствует пониманию контроля качества митохондрий и его влияния на старение.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Quantitative imaging of mitochondrial hydrogen peroxide in live yeast cells enables precise interrogation of mitochondrial redox status, a key determinant in cellular health and disease modeling. The mtHyPer7 biosensor provides robust, reproducible readouts for oxidative stress, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines. This capability enhances predictive confidence for mitochondrial function studies relevant to aging, metabolic disorders, and cellular quality control.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of mitochondrial H2O2 to clarify redox-driven mechanisms.
- Supports functional validation of mitochondrial quality control pathways.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing signaling from damaging oxidative events.
- Provides stable, genome-integrated biosensor expression for consistent biological interrogation.
Screening & Assay Development
- Delivers quantitative, ratiometric outputs suitable for assay standardization and reproducibility.
- Prepares validated yeast models for compound screening targeting mitochondrial redox modulation.
- Enables high-content imaging workflows with robust signal stability and minimal background interference.
- Supports scalable, platform-ready readouts for comparative compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial redox measurements with disease-relevant phenotypes in model systems.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation of mitochondrial-targeted interventions.
- Provides quantitative endpoints for risk-adjusted advancement decisions in mitochondrial research portfolios.
- Facilitates biomarker development for oxidative stress and mitochondrial dysfunction.
Pipeline & Workflow Integration
The mtHyPer7 imaging workflow integrates from early discovery through assay development and preclinical research, supporting hypothesis-driven studies and translational continuity.
- Discovery Biology: Quantitative biosensor imaging enables hypothesis testing of mitochondrial redox mechanisms and pathway mapping.
- Screening: Ratiometric outputs and stable expression support reproducible, scalable assay development for compound screening.
- Analytics: Enables robust statistical comparison of mitochondrial H2O2 levels across conditions and cell populations.
- Translational Research: Provides disease-relevant, quantitative endpoints for preclinical model validation.
- Enterprise Reuse: Genome-integrated biosensor lines and open-source analysis scripts facilitate cross-project and cross-team adoption.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mitochondrial target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and reduces late-stage biological risk in mitochondrial research programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mitochondrial targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and quantitative fluorescence analysis.
- Needs access to spinning-disk confocal microscopy and compatible analysis software (e.g., Fiji/ImageJ).
- Demands cross-team standardization of imaging parameters and analysis scripts for reproducibility.
- Adaptable to other biosensors and model systems with protocol optimization.
- Dependent on consistent genome integration and expression for reliable outputs.
