Получение почечных органоидов в суспензии из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток
1 сентября 2023 г.
Этот протокол представляет собой комплексный и эффективный метод получения почечных органоидов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с использованием условий суспензионного культивирования. Основной акцент в этом исследовании делается на определении начальной плотности клеток и концентрации агонистов WNT, что приносит пользу исследователям, заинтересованным в исследовании органоидов почек.
В нашем исследовании представлен комплексный и эффективный метод получения почечных органоидов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием условий суспензионного культивирования. Мы подчеркиваем важность начальной плотности клеток и концентрации агонистов WNT во время индуцирующей фазы, что позволит обучить новых исследователей органоидов. В настоящее время трудно получить единую клеточную линию высокой плотности для ИПСК.
Влияние партии было заметным, особенно в различных линиях ИПСК. Почечные органоиды каждой партии могут иметь различную форму и размер. Для получения наилучшей исходной плотности клеток и концентрации CHIR для одной линии iPSC необходимо несколько попыток.
Установлено, что для успешного формирования органоидов почек важна начальная дифференциация промежуточного метода. Наш протокол подробно описывает, как выбрать оптимальную плотность клеток и концентрацию CHIR во время процесса, поскольку различные линии ИПСК показали различия в способности клеток к пролиферации и дифференцировке. Исследователи могут быстро генерировать специфические почечные органоиды из своих ИПСК.
Согласно нашему протоколу, регулируя плотность клеток и концентрацию CHIR, всем нашим исследователям, несомненно, полезно сосредоточиться на заболевании почек. Наши лабораторные исследования в будущем должны быть направлены на оптимизацию метода протокола в моделях заболеваний, регенерацию новых лекарств и скрининг лекарств. В последние пять лет наша лаборатория сосредоточится на эпигенетике и разработке клеточных препаратов для различных наследственных заболеваний почек, основанных на развитии пациентов, ИПСК и моделях организованных заболеваний почек.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе представлен комплексный и эффективный метод получения органоидов почек из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) с использованием условий суспензионного культивирования. В исследовании подчеркивается важность начальной плотности клеток и концентрации агониста WNT, что дает ценную информацию для исследователей, занимающихся изучением органоидов почек.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология стволовых клеток
- Исследования органоидов
Теоретические основы
- Органоиды почек имеют важное значение для изучения развития и заболеваний почек.
- Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) являются перспективным источником для создания органоидов.
- Существуют сложности в получении стабильных высокоплотных клеточных линий иПСК.
- В разных партиях иПСК может наблюдаться вариабельность формы и размера органоидов.
Цель исследования
- Разработать надежный метод получения органоидов почек из иПСК.
- Определить оптимальную начальную плотность клеток и концентрацию агониста WNT.
- Оказать помощь новым исследователям в области технологии органоидов.
Используемые методы
- Условия суспензионного культивирования для формирования органоидов.
- Оценка исходной плотности клеток и концентрации агониста WNT.
- Сравнение характеристик органоидов для различных линий иПСК.
- Итеративная оптимизация условий культивирования для достижения наилучших результатов.
Основные результаты
- Начальная плотность клеток оказывает значительное влияние на развитие органоидов.
- Концентрация агониста WNT имеет решающее значение для успешного формирования органоидов.
- Среди различных линий иПСК наблюдалась вариабельность морфологии органоидов.
- Для достижения оптимальных условий может потребоваться несколько попыток.
Выводы
- В данной работе представлен ценный протокол получения органоидов почек.
- Понимание роли плотности клеток и концентрации WNT имеет принципиальное значение.
- Данное исследование будет способствовать развитию изучения органоидов почек.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Генерация органоидов почек из иПСК методом суспензионного культивирования позволяет создавать масштабируемые и воспроизводимые модели заболеваний для ранних стадий поиска лекарственных средств и скрининга нефротоксичности. Оптимизация исходной плотности клеток и концентрации агониста WNT напрямую влияет на прогностическую достоверность и стандартизацию анализов на основе органоидов. Данный протокол обеспечивает непрерывность трансляционных исследований и снижение рисков по всему портфелю при валидации почечных мишеней и оценке соединений.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Позволяет исследовать пути развития почек и механизмы заболеваний в контролируемой 3D-системе.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем воспроизведения структур нефрона из различных линий иПСК.
- Способствует снижению механистических рисков за счет воспроизводимой дифференцировки и формирования органоидов.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение стандартизированных органоидов без использования компонентов животного происхождения для скрининга соединений и оценки нефротоксичности.
- Позволяет получать количественные, воспроизводимые результаты за счет контроля плотности клеток и воздействия агониста WNT.
- Обеспечивает масштабируемость и возможность повторного использования платформы для различных линий iPSC и моделей заболеваний.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует методам моделирования наследственных заболеваний почек с использованием иПСК, полученных от пациентов.
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации, позволяя проводить исследования ответа на лекарственные препараты в органоидах.
- Снижает трансляционный риск, предоставляя релевантные человеческие структуры нефрона для изучения биомаркеров и эффективности.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол интегрирован в континуум от поиска мишени до доклинических исследований, обеспечивая раннюю валидацию мишеней, идентификацию соединений-лидеров и трансляционные исследования в области биологии почек.
- Фундаментальная биология: Способствует проверке гипотез и уточнению путей развития почек и механизмов заболеваний.
- Скрининг: Обеспечивает получение воспроизводимых органоидов, готовых к анализу, для оценки соединений и профилирования токсичности.
- Аналитика: Предоставляет количественные показатели формирования структуры нефронов и функционального захвата (например, декстрана в проксимальных канальцах).
- Трансляционные исследования: Позволяет проводить моделирование заболеваний и изучение ответа на препараты в специфичных для конкретного пациента органоидах.
- Повторное использование в масштабах предприятия: Предлагает стандартизированный, адаптируемый протокол для различных линий иПСК и моделей заболеваний почек.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования и снижает неопределенность механизмов при валидации почечных мишеней.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и масштабируемость за счет использования определенных условий культивирования без применения животных.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала благодаря внедрению надежных анализов, релевантных для человека.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию с учетом рисков и продвижение кандидатов в препараты для лечения заболеваний почек.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культивированием, дифференцировкой и манипуляциями с органоидами из иПСК.
- Необходим доступ к планшетам с низкой адгезией, орбитальным шейкерам, а также к методам количественной визуализации или функционального анализа.
- Для обеспечения воспроизводимости необходима межгрупповая стандартизация плотности клеток и концентрации агониста WNT.
- Методика должна быть адаптирована с учетом вариабельности различных линий иПСК и специфических моделей заболеваний.
- Межсерийная вариабельность морфологии и размера органоидов требует итеративной оптимизации.
