Количественный анализ стабилизации мембраны эндоплазматического ретикулума (MAM), ассоциированной с митохондриями, в нейронной модели болезни Альцгеймера (БА)

Мы пытаемся количественно измерить стабильность митохондриальных ассоциированных мембран ER различной толщины или ширины зазора, что важно для регуляции патофизиологии нескольких нейродегенеративных заболеваний, включая БА. Недавние исследования митохондриально-ассоциированных мембран ER, часто называемых MAM, описали их как один из ключевых факторов в инициировании амилоидной патологии на ранней стадии болезни Альцгеймера. Полученные результаты привели к разработке новой гипотезы, называемой гипотезой MAM, которая предполагает, что болезнь Альцгеймера является исключительно заболеванием, связанным с MAM.

Наш протокол является первым, который предоставляет количественный инструмент для измерения стабилизации MAM в живых клетках, что до сих пор оставалось сложной задачей. Самое большое преимущество нашего протокола заключается в том, что он использует внутренние динамические свойства митохондрий для количественного измерения изменений стабилизации MAM при сужении или ослаблении ширины зазора MAM в живых клетках.

В ближайшем будущем мы сосредоточимся на улучшении и использовании нашей современной визуализации живых клеток и кимографической техники для скрининга серии одобренных FDA синтетических или натуральных низкомолекулярных модуляторов MAM или MAM связанного сигма-одного рецептора с использованием недавно разработанной платформы для скрининга лекарств от болезни Альцгеймера и понимания механизма их действия.

[Рассказчик] Чтобы трансфицировать клетки стабилизаторами МАМ, замените мононуклеарную смесь костного мозга двумя миллилитрами среды DMEM-F12 комнатной температуры в каждой лунке. Комбинируйте нуклеофекторный реагент с добавкой один в соотношении 4,5 к одному. Добавьте в смесь 100 микролитров реактива нуклеофектор. Затем сделайте вихревой раствор ДНК. Добавляйте от одного до пяти микрограммов ДНК за одну обработку в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом один миллилитр для каждой трансфекции. После отсасывания имеющихся сред из клеток промойте клетки один раз 10 миллилитрами PBS. Аспирируйте PBS и добавьте один миллилитр аккутазы непосредственно в клетки. Инкубируйте клетки в течение пяти-10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем аккуратно постучите по стенке посуды, чтобы выбить ячейки. Под микроскопом убедитесь, что клетки ослаблены и свободно текут. Нейтрализуйте клетки с помощью 10 миллилитров среды DMEM-F12 и переложите клеточную суспензию в чистую 15-миллилитровую пробирку. Затем возьмите 10 микролитров взвешенных клеток и добавьте их на сторону А камеры для подсчета клеток. Затем вставьте сторону А заполненной камеры в основную прорезь на передней части счетчика ячеек. Нажмите, измерьте и запишите количество ячеек на миллилитр. Центрифугируйте необходимое количество ячеек при 300 G в течение пяти минут. Затем осторожно аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах нуклеофекторной смеси для каждой электропорации. Далее добавьте 100 микролитров суспензии ресуспендированных клеток в одну из пробирок, содержащих ДНК. Перемешайте, пипетируя раствор несколько раз. Затем переложите смесь клеток ДНК в электропорационную кювету и запечатайте ее прилагаемой крышкой. Выберите подходящую нуклеофекторную программу на приборе. Немедленно добавьте примерно 500 микролитров DMEM из предварительно заполненной шестилуночной пластины в кювету с помощью стерильных пипеток. Аккуратно перемешайте один раз и переложите электропорированные элементы и среду в соответствующую лунку. Для начала поместите шестилуночный планшет с клетками в камеру микроскопа и отрегулируйте фокус микроскопа до тех пор, пока клетки не станут видимыми. Чтобы поймать сигнал красного флуоресцентного белка, возбудите флуорофор с помощью лазера с яркостью 594 нм и установите излучение на 570–640 нм. Для зеленого флуоресцентного белка используйте 488-нанометровый лазер для возбуждения с излучением от 510 до 540 нанометров. Обрежьте область сканирования так, чтобы она соответствовала аксону. Меньшая площадь сканирования сократит время обработки и упростит создание нимографии. Установите интервал одним кадром в секунду, а общую продолжительность — 181 секунду. Нажмите кнопку «Выполнить», чтобы начать процесс. Аксональная скорость меченых MAM 1X ER-связанных митохондрий была снижена на 50% по сравнению со свободными и MAM 9X связанными митохондриями. 26,6% митохондрий MAM 1X были подвижными по сравнению с 53,82% свободных митохондрий и 44,79% митохондрий MAM 9X. Ретроградное движение было ниже для митохондрий MAM 1X, чем для митохондрий Mito-RFP и митохондрий MAM 9X. Антероградное движение митохондрий MAM 1X также было снижено по сравнению с Mito-RFP. Стационарный процент митохондрий MAM 1X был значительно выше, чем у митохондрий MAM 9X, что отражало снижение подвижности, в то время как общая скорость митохондрий MAM 1X была значительно ниже, чем у митохондрий MAM 9X.